[发明专利]脂质体的两相制备方法及其在制造诊断试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及脂质体的两相制备方法，在其过程中，使用技术上简单的机械方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的单独混合物的非极性有机相和与其不混溶的极性水（缓冲液）相。当活性组分锚定到脂质体膜的表面时，用本方法制备的具有独特结构的脂质体乳剂优选体外应用。

此外，本发明可能的实施方式涉及体外血液凝固诊断试剂的制备。在本发明的一组实施方式中，所述试剂由我们的提供用于活性组分和蛋白类型的活性组分的膜表面的具有独特结构的脂质体乳剂，即天然或重组组织因子，组成。在这个组的可能的实施方式中，在初步制备的脂质体上实现将蛋白锚定到膜表面。在这个组进一步可能的实施方式中，蛋白的锚定与脂质体膜表面的组装同时进行。在另一组实施方式中，所述试剂由我们的具有独特结构的脂质体乳剂和与所述乳剂通过简单的机械混合混合的非蛋白类型的可溶活性组分组成。非蛋白类型的可溶活性组分可为有机酸或无机化合物（例如，鞣花酸、鞣酸、芸香苷、槲皮苷或无机二氧化硅）。

本发明的主题为方法，作为其中可能的实施方式，制备了体外血液凝固诊断试剂。通过我们的方法制备的所述体外血液凝固诊断试剂适于测量凝血酶原时间和激活部分促凝血酶原激酶时间。本说明书的进一步的主题为上述方法可能的商业实现。

背景技术

血液凝固诊断中最常用的进行的测量目的为测定凝血酶原时间(PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。两种诊断方法监控血液凝固系统的酶过程，以显示检测的有机体的止血状态。

血液凝固是一个由复杂的增多和减少的生化步骤组成的级联型酶链反应。血液凝固系统的酶反应中决定性的多数为包括蛋白和非蛋白类型分子（酶和辅因子）和膜组分的膜结合过程。膜组分的主要构成为起基本结构（锚定）和功能（例如酶活性辅因子）作用的极性和非极性脂质。为在体外系统中模拟体内膜结合过程，膜功能可被脂质化的特定过程支持，为体内系统提供合适的脂质成分。

根据本发明，体外血液凝固诊断试剂中含脂质的组分为脂质体，即具有小于微米范围的直径的脂囊泡，其与合适组成的水溶液形成稳定的乳剂。所述脂质体提供体外血液凝固诊断反应所必需环境的膜表面，即它们适于锚定有机化合物（例如具有合适氨基酸序列的天然或重组蛋白）并适于与具有合适结构的有机或无机化合物结合。此外，脂质体膜的表面在锚定的活性蛋白或可溶活性无机化合物的表面活性反应中起到辅因子的作用。

PT和APTT测量旨在确定作为血液凝固系统的中心步骤的血浆纤维蛋白原的聚合时间，即非活性凝血素变化为活性凝血酶时间。

PT测量利用所谓的促凝血酶原激酶的凝血启动效应，即所谓外在凝血途径的起始[Mackman N.等，(2007)：Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27：1687至1693]。促凝血酶原激酶包括含在磷脂膜中的组织因子（TF，凝血因子III）。组织因子为与膜重叠的跨膜糖蛋白[Bazan J.F.(1990):PNAS 87,6934-6938.]。虽然健康个体的循环血液中的组织因子的可检测水平有争议[Monroe D.M.,Key N.S.(2007):J.Thromb.Haemost.5:1097-1105.]，当血管床损伤时，膜结合的组织因子由沿损伤的细胞（例如内皮细胞和白细胞）释放，从而启动血液凝固级联反应。释放的膜结合组织因子结合并激活凝血因子VII，因此膜结合组织因子起到激活的凝血因子Vila的辅因子和受体的作用。膜结合组织因子和激活的凝血因子VIIa在Ca²⁺离子存在下促进凝血因子X的激活。由凝血酶原酶复合体触发凝血素转变为凝血酶，凝血酶原酶复合体由激活的凝血因子X（即因子Xa）和激活的凝血因子V（即因子Va）组装，后者起到调节蛋白的作用。凝血酶将纤维蛋白原蛋白链裂解成纤维蛋白单体。凝血酶还激活因子XIII；激活的因子XIIIa形成转谷氨酰胺酶家族的连接酶，起到纤维蛋白的稳定因子的作用。在激活的纤维蛋白稳定因子XIIIa的影响下，通过共价交联由纤维蛋白单体产生纤维蛋白聚合物，即稳定的纤维蛋白网络（Edgington T.S.等，(1991)：组织因子的表达和功能的结构生物学，Thrombosis and Haemostasis，66：67-79）。

如上述，促凝血酶原激酶为包含锚定到合适组成的脂质膜的组织因子的膜复合体。此外，与环绕脂质膜结合的蛋白的存在是在时间和空间上血液凝固级联反应的启动中的关键。通过动物或人富含脂质的内皮组织与水溶液的均匀化，产生绝对多数现有的PT试剂。然而，在一些先进的产品中，应用与人造脂质结构结合的含重组组织因子的促凝血酶原激酶。