[发明专利]结合至血管内皮生长因子2（VEGFR-2/KDR）上并阻断其活性的重组抗体结构

说明书

技术领域

本发明的主要目的是获得可以作为抑制剂参与血管生成的重组单链可变区片段抗体，其通过与VEGFR2（细胞外结构域）相互作用，在肿瘤发展中并因而在与血管生成相关的疾病机制中起关键性作用。

背景技术

活组织的发育所需要的氧气和营养物质通过血管被运送到组织而废物质也通过血管被运出组织。虽然血管生成，从已经存在的血管中生长新血管，是胚胎发生、伤口愈合、和女性生殖系统的月经期间的生理现象，它病理性地出现在炎性疾病中，如关节炎、慢性炎症、炎症性肠道疾病、和牛皮癣以及各种组织的癌症如乳腺、膀胱、结肠、肺、神经母细胞瘤、黑色素瘤、肾、胰腺、子宫、子宫颈、和胶质母细胞瘤，以及眼科疾病如老年相关的黄斑变性。

血管生成在固体肿瘤的体内形成、发展和转移中的意义在1971年第一次被认定（Folkman J.,1971,N Eng J Med.,285,1182-1186）。通过毛细血管内皮细胞的增殖出现血管生成（Risau W,1997,Nature,386,671-674）。与所有生物事件一样，生物体通过分泌血管生成抑制因子对血管生成刺激做出反应。在正常情况下血管生成促进因子和血管生成抑制因子处于平衡状态，并且当这个平衡针对血管生成抑制因子被破坏时，血管生成开始。在1989年Ferrara等人定义了血管内皮生长因子（VEGF）（Ferrara and Henzel,1989Biochem Biophys Res Commun161,851-858）。在血管生成中VEGF起着关键的作用（Ferrara N et al.,1996,Nature,380:439-442）。在小鼠上的实验表明，由于严重的血管问题，仅缺失关于VEGF的等位基因导致早期胚胎死亡（Carmilet P.et al.,1996,Nature,380,435-439）。VEGF是重量为45kDa的以二硫键结合的结合肝素的同型二聚体碱性蛋白质。目前已经定义了其多个亚组，如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及VEGF-E。在哺乳动物中，VEGF-A具有多种亚型，如VEGF₁₂₁，、VEGF₁₆₅，VEGF₁₈₉，VEGF₂₀₆和VEGF₁₄₅（基于氨基酸数目）。在这些亚型中，VEGF₁₆₅是主要的种类（Ferrara N.,et al.,2009,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,29,789-791）。

通过结合至细胞膜上的酪氨酸激酶受体，VEGF显示其细胞内作用。VEGF受体包含两部分。第一部分是包含酪氨酸激酶结构域的细胞内部分。第二部分是包含5至7个免疫球蛋白样结构（其包含配体结合区域）的细胞外区域（Ferrara N.et al.,2003,Nat.Med.9:669-676）。除了证明Flt-1（VEGFR-1），flk-1/KDR（VEGFR-2），和Flt-4（VEGFR-3）为VEGF受体外，最近已经定义了称为跨膜蛋白-1（neuropilin-1）和跨膜蛋白-2（neuropilin-2）（其在内皮细胞表面上表达并且对VEGF-A具有低结合特性）的受体结构。KDR（包含激酶插入结构域的受体）已于1991年被Terman等人通过专利号PCT/US92/01300定义（Terman et al.,1991,.Oncogene6:1677-1683）。在1991年通过测序方法揭示Flk-1的序列（Mathhews W et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,88:9026-9030）。这些研究已经证明KDR是FLK-1受体的人类类似物。此外，KDR和FLK-1受体也被称为VEGFR2。