[发明专利]针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及了基因工程和疫苗学领域。具体地，本发明涉及针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途。更具体地，本发明涉及优化的适合毕赤酵母表达的人乳头瘤状病毒的主要衣壳蛋白L1的编码序列，以及高效生产主要衣壳蛋白的方法。本发明还涉及由主要衣壳蛋白自组装形成的HPV的病毒样颗粒(HPVVLP)以及含HPV VLP的疫苗组合物。

背景技术

宫颈癌的发病率在最常见的妇女癌症中，尤其是发展中国家，排居第二。自从1983-1984年间发现HPV病毒感染与宫颈癌发生的相关性后，至今已经分离到了至少118种人乳头瘤状病毒，且现已被证实在肛生殖系统癌症中由HPV感染所诱发的癌症占3.7％。

在已被分离出的一百多种HPV病毒亚型中，已发现有15种具有诱导生殖系统癌症的发生因而被归为高危性HPV病毒亚型(例如HPV16，18，31，33，52和58)，其中HPV16和HPV18两种亚型在全世界占所有由HPV感染诱发宫颈癌的70％。继HPV16和HPV18之后，HPV52和HPV58在亚洲和非洲的具高患病率，占全世界宫颈癌发病率的2-3％。

目前的研究资料表明，在中国，宫颈癌的发生率居高不下，是对目前妇女健康威胁性最高的问题之一，尤其是在中国的农村地区。

中国地区的人乳头瘤状病毒的流行病学研究发现，中国地区HPV58病毒的检出率是仅次于HPV16病毒。

当然，人乳头瘤状病毒的患病率在整体人群中呈现病毒亚型特异性分布。在山西，广东和辽宁等地区，虽然HPV病毒型呈现不同分布特征，但是在这些地区中最常见的HPV病毒感染亚型为HPV16，其次分别为HPV58和HPV52。

在最近一项大规模中国妇女HPV病毒亚型分布数据分析表明，整体上HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亚型)在侵入性子宫颈癌(ICC)为82.7％，在高度鳞状上皮内病变(HSIL)中为88.5％和在低度鳞状上皮内病变(LSIL)为69.3％。在侵入性子宫颈癌ICC中，HPV16为最常见亚型，HPV18居于HPV16之后。在ICC病例中，居于HPV16、HPV18之后的为HPV58，HPV52和HPV31。

自HPV病原体被确认后，科学家们开始进行大量研究并发现，将HPV病毒样颗粒(VLPs)中的主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2构建进痘病毒内，两种蛋白表达后能自主组装成病毒样颗粒，其形态和免疫原性都与天然病毒颗粒相似。基于该发现，一些实验室和公司研制了含有HPVL1和/或L2及VLPs的单价或多价疫苗，并且发现：与L2相比，L1疫苗具有更强的抗原性和免疫原性。

含不同亚型或混合型HPV的VLPs/L1蛋白预防性疫苗已相继被成功研制并开始在临床实验上使用。其中美国默克公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的四价疫苗，英国的葛兰素史克公司研究出了含有HPV16和HPV18的两价疫苗，临床结果表明两种疫苗的安全性和有效性都较好。

虽然某些HPV亚型的VLPs/L1的制备已经成功，然而，对于某些亚型VLP的制备却极其困难。例如，出于某种未知的原因，迄今为止，本领域尚没有成功地工业化生产HPV52和HPV58亚型的L1蛋白/VLP的报道。

至今还没有人体对具有不同基因型的各HPV病毒亚型之间存在交叉反应的报道，因此针对某一病毒亚型的特异性疫苗通常只能使得接种者对该特定病毒亚型有预防效果。为使易感人群或患者具有针对抗一种以上病毒亚型(尤其是多种高危HPV)的预防免疫功能或治疗效果，则需对该人群联合施用针对几种相应的不同病毒亚型疫苗。因此，研制同时针对几种不同HPV亚型且适合在多种不同HPV亚型流行地域内使用的预防混合疫苗，将使接种的对象获得针对几种不同高危HPV病毒亚型的免疫力，从而预防和降低宫颈癌的发病率以及治疗宫颈癌患者的有效治疗。

就目前的HPV疫苗的生产工艺而言，大多采用大肠杆菌或酿酒酵母作为工程菌进行生产。其中，大肠杆菌的表达的L1蛋白没有被正确折叠和修饰，以包涵体的形式表达，因此要组装成病毒样颗粒L1蛋白需要经过变性和复性的过程，纯化工艺复杂。同时体外组装的病毒样颗粒的免疫原性低于真核表达并自主组装的病毒样颗粒。

用酿酒酵母生产HPV的VLP也存在一些明显的缺点。例如，在酿酒酵母中，外源的HPVL1基因存在于质粒中，而非染色体上，因此在培养或发酵生产过程中易发生质粒丢失。酿酒酵母易导致过度糖基化，从而导致所生产的VLP在某些个体中产生不利的过敏反应。酿酒酵母无法采用高密度发酵，另外培养基等原因导致发酵成本高，这些都造成生产成本居高不下。