[发明专利]预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域，是一种重型肝炎相关基因谷胱甘肽S-转移酶M3启动子甲基化状态信息及其应用。具体涉及检测与重型肝炎相关的基因谷胱甘肽S-转移酶M3启动子甲基化状态的方法和试剂盒。

背景技术

慢加急性重型肝炎(ACLF)指已确诊或未经诊断的慢性肝炎患者病情急性发作，表现为以黄疸和凝血障碍为主的肝损伤，4周内并发腹水和(或)肝性脑病。西方国家重症肝炎以药物、乙醇等中毒所致的急性肝衰竭为主，而我国的重症肝炎则多由肝炎病毒，尤其是乙型肝炎病毒(HBV)所致(约占70％)。我国是HBV感染高发区，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者约有9300万例，其中约2000万例为慢性乙型肝炎患者。化学和生物毒物、乙醇、药物、HBV耐药变异、免疫抑制剂、合并感染、Wilson病、自身免疫性肝病和妊娠等因素可导致慢性HBV感染者急性发病，表现为慢加急性肝功能衰竭，称为慢加急性重型乙型病毒性肝炎(ACHBLF)。当前，乙型肝炎的抗病毒治疗已取得长足的进展，但重型乙型肝炎的发病率及病死率仍居高不下。该疾病病情凶险，发展迅猛，临床上缺乏确定病情、判断疗效和预后的评估体系，至今没有有效的治疗方法和干预手段，绝大部分患者预后不佳，严重威胁患者的生命。因此，揭示乙型肝炎重症化的机制，建立有效的针对性综合评估体系和防治手段尤为重要。

乙型肝炎重症化是多基因、多因素所致，其发病机制十分复杂，目前认为，重症乙型肝炎发生和发展由宿主(如生物遗传特征、细胞凋亡和坏死、免疫损伤机制等)和病毒(如病毒复制、病毒变异、病毒基因型等)两方面相互作用所影响。有研究表明，慢性HBV感染的重症化过程中表观遗传易感性发挥作用，表观遗传学漂移可以导致患者对疾病的易感和转归不同，个体特征差异明显。脱氧核糖核酸(DNA)甲基化是表观遗传的重要机制之一，它指在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，将一个甲基添加在DNA分子中的碱基胞嘧啶上，形成5甲基胞嘧啶。甲基化主要发生在CpG序列上，其中，C代表胞嘧啶，P代表磷酸酯键，G代表鸟嘌呤。CpG岛大小约500-1000bp，GC含量超过55％，56％的编码基因位于转录起始区的重复序列含有CpG岛。CpG岛的甲基化与基因转录活性密切相关，DNA甲基化导致基因沉默，相反，非甲基化一般与基因活化相关联。最近有研究发现，HBV进入机体后可以诱导宿主DNMT活性增加，DNMT催化病毒DNA启动子甲基化，发挥抑制病毒的作用。另一方面，病毒基因被甲基化的同时，活性增加的DNMT同时对宿主的某些基因进行选择性甲基化修饰，导致人体某些基因启动子CpG岛被甲基化修饰，基因表达水平降低。

重型肝炎患者氧化应激可以加重肝脏损伤。另有研究表明慢性乙型病毒性肝炎、慢性丙型病毒性肝炎、肝硬化、酒精性肝病患者生物抗氧化能力减弱，氧化损伤加重，与患者肝损伤程度相关。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是重要的Ⅱ相代谢酶，主要催化谷胱甘肽和亲电性物质之间的反应，即促进谷胱甘肽与毒性代谢产物结合，消除细胞内自由基，减轻氧化损伤。GST超家族主要分为α、μ、π、θ共4个亚家族，分别为GSTA、GSTM、GSTP、GSTT。亚家族各成员参与不同化学物质的代谢，但彼此间底物有部分重叠，其中GSTM的作用尤为突出。研究表明，GSTM表达缺失是原发性肝癌、药物诱导的肝损伤、酒精性肝硬化、非酒精性脂肪肝、丙型肝炎慢性化的危险因素。GSTM3是GSTM亚家族的重要成员之一，其表达水平与基因启动子甲基化水平负相关。GSTM3启动子高甲基化可以使GSTM3表达下调，可能导致机体抗氧化能力降低，氧化损伤加重，肝功能受损。基于以上研究，本发明人首次提出了GSTM3启动子的甲基化与重型肝炎有关。对GSTM3启动子的甲基化状态进行检测可以应用于重症肝炎患者提示预后及指导治疗。

本发明采用的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)法是目前使用最广泛的DNA甲基化检测方法，与其它甲基化检测方法相比，其优点是标本需要量；灵敏度高；实验时间较短，操作相对简便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测重型肝炎相关基因谷胱甘肽S-转移酶M3(GSTM3)启动子甲基化状态的试剂盒，以及简便可行的检测方法，其检测结果为重型肝炎的临床诊治提供科学依据。

本发明是这样实现的，本试剂盒内设有：对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂，针对人谷胱甘肽S-转移酶M3(GSTM3)基因的启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对，以及2×Taq PCR MasterMix酶。