[发明专利]猪圆环病毒Ⅱ型毒种的制备和保存方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒II型毒种的制备和保存方法。

背景技术

猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是圆环病毒(PCV)两种基因型中的一种，小颗粒、无包膜、环状单股DNA病毒，属环状病毒科，临床感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。近年来，人们一直在致力于PCV2引起的PMWS的疫苗、诊断试剂和治疗方法的开发应用研究，但这些研究的前提是获取足量的PCV2病毒。现今生产中多采用如下方法制备和保存毒种：猪圆环病毒II型(PCV2)毒种接种37℃培养24-48h形成单层的PK15细胞，加入含体积比1-5％新生牛血清的MEM营养液，于37℃培养72-96h，冻融裂解细胞，使之释放病毒，收获细胞培养物，用IFA方法检验，于-80℃冰箱中保存。该制备方法和保存方式存在一些缺陷，主要表现：

(1)病毒滴度较低：PCV2在细胞中的生长滴度较低，病毒含量都低于10^5.0TCID₅₀/mL，一般仅为10^3.0TCID₅₀/mL左右，病毒的含量不能满足疫苗和诊断抗原等的制备，而病毒的含量是PCV2制剂大规模制备应用的关键。因此，高质量的毒种成为PCV2生产中急待解决的棘手问题；

(2)生产工艺繁琐：当前所使用的毒种制备方法，需要重复的接种、冻融收获，工艺很繁琐；

(3)增加成本：由于工艺很繁琐，涉及更多的设备及物耗，造成成本的增加。

发明内容

针对当前猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2，PCV2)毒种的制备和保存方面存在的不足，本发明提供一种病毒滴度高、免疫原性好、工艺简洁、经济实用的猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)毒种的制备和保存方法。 本发明的方法能持续稳定产出高滴度的PCV2，病毒的滴度可达到10^6.06.5TCID₅₀/ml，显著高于现有技术水平。本发明方法得到的病毒滴度稳定，简化了病毒浓缩等工艺，减少设备购置，可有效降低成本，利于PCV2疫苗等制剂的生产和相关诊断试剂的制备。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)毒种的制备和保存方法，其特征在于步骤如下：

(1)接种用细胞的制备

PK15(猪肾细胞系)细胞按常规条件培养24小时后，80-90％细胞融合时作为接种用细胞；

(2)病毒的接种培养

取接种用细胞，弃去生长培养基，以毒种：接种用细胞为1-10％(v/v)或病毒滴度为10^3.0-10^6.0TCID₅₀/mL的比例接入猪圆环病毒II型毒种，37℃吸附1小时后加入维持液进行培养；24小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37℃处理20分钟，经无菌pH7.4的PBS两次洗涤后加入维持液进行培养；

(3)传代

取培养后的细胞，弃去维持液，经无菌pH7.4的PBS两次洗涤后，加入细胞分散液，将细胞分散成3-6×10⁶/mL，定量分装细胞瓶中，37℃培养48-96小时；

(4)连续传代

重复步骤(3)，传代3-6次，得含毒种PK15细胞；

(5)保存

含毒种PK15细胞置于液氮内进行保存。

其中，上述步骤(1)至(4)为本发明猪圆环病毒II型毒种的制备方法；步骤(5)为本发明猪圆环病毒II型毒种的保存方法。

进一步，本发明的猪圆环病毒II型毒种的制备和保存方法，在步骤(2)病毒的接种培养中，以毒种：接种用细胞为5％(v/v)的比例接入猪圆环病毒II型毒种。

进一步，本发明的猪圆环病毒II型毒种的制备和保存方法，传代培养72h， 连续传代5次。

其中，保存中取含毒种PK15细胞，弃去维持液，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入细胞分散液，将细胞分散成3-6×10^7-8/mL，定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。