[发明专利]基于PCR的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种串联重复序列的构建方法，尤指一种用PCR快速构建串联重复序列的方法及该方法在酵母单杂交中启动子核心重复序列构建中的应用。

背景技术：

真核生物中各种转录因子在转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。典型的转录因子都有DNA结合区与转录激活区(或抑制区)，在特定的时间、部位或特定条件(如胁迫条件)下，特定的转录因子与靶基因启动子的顺式作用元件特异性结合并相互作用，就可以激活或抑制靶基因的表达。

要阐明细胞内各种信号转导与基因表达的机制，以及细胞对外界环境刺激引起的一系列信号传递与应答基因表达调控等机理，鉴定各种调控基因表达的顺式作用元件和转录因子至关重要。

酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆或鉴定转录因子基因。而该酵母单杂交方法中，构建酵母报道子是用酵母单杂交方法鉴定特定转录因子中的一个重要内容。报道子的结构是将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子P_min上游，P_min启动子下游连接报道基因。进行cDNA融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体转化进入酵母细胞后，其编码产物(转录因子)与顺式作用元件结合，就可以激活P_min启动子，并促使报道基因表达。一般来说，需要在最基本启动子Pmin上游构建3个以上按同一方向串联连接的顺式元件的重复序列。但是，现有构建顺式元件重复序列通常采用在顺式作用元件的两端加同一酶切位点，进行酶切后回收再用T4连接酶连接。由于顺式作用元件通常较小(小于100bp)，回收的效率低，同时连接时会出现正向连接和反向连接两种情况，出现3个以上的重复片段的机率很小，只有约2％左右，筛选和鉴定相当麻烦。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于PCR的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用，具体地说，就是用PCR的方法快速，构建一系列重复基因，用于酵母单杂交中启动子核心重复序列的构建，也可用于构建快速重复系列表达相同的蛋白结构域。

为了解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是：一种用于扩增低拷贝方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的引物对，其特点是：所述引物对是根据目的顺式作用元件的序列来设计，正向引物取目的顺式作用元件序列的前20bp；反向引物由两部分组成，前半部分27个碱基取目的顺式作用元件序列的前27bp的反向互补序列，后半部分23个碱基取目的顺式作用元件序列的最后23bp的反向互补序列。

一种基于PCR的串联重复序列快速构建法，该方法是以按上述引物对的设计方法，根据目的顺式作用元件设计的引物对，对目的顺式作用元件进行PCR扩增，得到方向相同的目的顺式作用元件的低拷贝串联重复序列。

本发明还可以上述低拷贝串联重复序列为模板，以根据目的顺式作用元件设计的引物对对其进行PCR扩增，可得到方向相同的目的顺式作用元件的高拷贝串联重复序列。该高拷贝串联重复序列在高分子重复蛋白质生产中应用极广。

上述目的顺式作用元件是DRE顺式作用元件。上述引物对为：

正向引物：5＞CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA＜3；反向引物：

5＞TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA＜3。

本发明还提供了上述引物对在构建酵母单杂交系统启动子核心重复序列中的应用。以及本发明构建法在构建酵母单杂交系统启动子核心重复序列中的应用。

本发明主要解决了现有技术中多拷贝DRE(3个以上)串联的问题。现有技术构建串联DRE序列通常采用酶切和连接的方法，将同一序列用Hind III进行单酶切后，由于两端的酶切位点相同，出现反接的概率达到50％，要想筛选到同向串联4个以上相当困难。采用本发明，设计一对引物，采用PCR法，不依赖于酶切和连接，就可以获得3个同向串联的克隆18％以上，而且，由于引物设计的原因，不会出现反接的现象。该方法快速、高效、简单，并且可能同时获得2×、3×、4×等一系列同向串联顺式作用元件的重复序列，没有颠倒连接的现象，也没有反复回收的麻烦，鉴定和筛选非常快捷方便。从而，大大简化了实验程序，加快了实验速度。此外，本发明还能获得200个以上的同向串联子，对于获得高拷贝重复序列，高拷贝高分子重复蛋白质也有极广泛的用途。

附图说明：

图1是用PCR法构建DRE串联子的原理图。