[发明专利]生脉注射液中微量蛋白的测定方法

权利要求书

1.一种生脉注射液中微量蛋白的测定方法，包括如下操作步骤：

（1）制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；

（2）抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0.5-5mg/只；数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10-20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；

（3）酶联免疫吸附试验:称取生脉抗原3mg-15mg，加包被液配制为2-50mg/ml储存液备用；用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100μg/ml - 2ug/ml浓度范围，100μl/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100μl包被；

4^oC湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2-3遍，拍干；用5%小牛血清溶液封闭10-15分钟；弃去溶液，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清1-3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G溶液避光室温孵育1-3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加100μl邻苯二胺/过氧化氢底物磷酸缓冲液，临用前10-15分钟配制：称取10-15mg邻苯二胺，用10-15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色；

显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm 处记录吸收度；

以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟，根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤（1）水煮提取1-4小时，所用乙醇浓度为45-85%。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤（1）回流10-180分钟，所用乙醇浓度为45-85%。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤（2）新西兰兔足趾内或皮下注射免疫，剂量以所含蛋白计为0.5-3mg/只。