[发明专利]生脉注射液中微量蛋白的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种测定生脉注射液中微量蛋白的方法。

背景技术

生脉注射液是临床应用多年的中药注射剂，主要用于治疗感染性休克、心源性休克和心肌梗塞等。

生脉注射液临床不良反应包括:过敏性皮疹、接触过敏性皮炎、腹胀、低血压、心动过速等，其中过敏反应发生率最高。引起生脉注射液过敏反应的原因很多，而蛋白等大分子物质是主要的致敏原。目前，检测过敏反应的方法一般采用动物试验的方法，例如用豚鼠、大鼠试验等。但这类试验至少有2个缺陷：1.检测周期过长，不适于中间体的测定；2.灵敏度低，对产品中含有潜在致敏危险的微量蛋白无法检出。

鉴于以上情况，急需一种灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的方法，以监控生脉注射液生产过程中的质量，防止临床使用中的过敏反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的方法。

本发明的目的是通过采用以下技术方案来实现的：

具体地说，本发明采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定生脉注射液中微量蛋白的方法，操作步骤如下：

1.制备生脉抗原：取人参、麦冬、五味子适量，加水提取，过滤,滤液加入乙醇，收取沉淀物，冻干, 制得生脉抗原；

2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫家兔制备兔抗生脉抗原抗体；

3.酶联免疫吸附试验（ELISA）:采用酶联免疫吸附试验法测定生脉注射液中的微量蛋白。

生脉抗原的制备中，原药材人参、麦冬、五味子的质量比为10:32.1:15.6。

优选操作方法如下：

1.制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；

2.抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0.5-5mg/只。数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10-20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；

3.酶联免疫吸附试验（ELISA）:

称取生脉抗原3mg-15mg，加包被液配制为2-50mg/ml储存液备用。用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100μg/ml-2ug/ml浓度范围，100μl/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100μl包被。4^oC湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2-3遍，拍干；用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液溶液, pH 7.4 ) 封闭10-15分钟；弃去溶液，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)1-3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸盐缓冲溶液稀释)避光室温孵育1-3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加100μl 邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H₂O₂）底物磷酸缓冲液，临用前10-15分钟配制：称取10-15mg邻苯二胺，用10-15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。

最佳操作方法如下：

1.制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮提取1-4小时，或回流10-180分钟，回流液过滤，滤液用45%-85%乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原。

2.抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为0.5-3mg/只。2-3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行1-4次免疫，新西兰兔耳中动脉采血1-2ml，分离血清，测定抗体滴度，如果抗体稀释度小于10^-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后新西兰兔颈总动脉采血，分离血清合并，封装，20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体。