[发明专利]一种阿维菌素产生菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及阿维菌素产生菌及其制备方法，具体地说是阿维菌素产生菌的变异株及其制备方法。

技术背景

阿维菌素(avermectin，AVM)是一类由除虫链霉菌(streptomycesavermitilis)经液体发酵产生的一类大环内酯类抗生素，是一种全新的无公害生物农兽药，其具有高效低毒与环境友好的特点，对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好防效，是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。目前除虫链霉菌发酵产生的阿维菌素中包括有结构类似的8种组分(AVMA1aAVMA1b AVMA2a AVMA2b AVMB1a AVMB1b AVMB2a AVMB2b)。其中B组分的生物活性优于A组分，尤以B1a活性最强。因此如何减低工业发酵产物中的A组分、提高B1a组分已成为人们研究的重点。例如，天津大学化工学院制药工程系李燕霞等人利用紫外线、亚硝基胍并结合L-异亮氨酸诱变手段对除虫链霉菌进行诱变处理，获得了可显著提高B1a组分产量的菌株，发酵单位比出发菌株提高12.86％(工业微生物2008年第38卷第一期)。CN200410009639.2公开了一种利用紫外线和亚硝基胍诱变筛选得到阿维菌素高产菌株的方法；CN200610149617.5公开了一株仅产生B1a和B2a的新菌株；但上述技术方案的生产水平仍有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的之一就是要提供一种新的阿维菌素产生菌，以大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分。

本发明的第二个目的就是要提供该菌株的制备方法。

本发明所提供的阿维菌素产生菌(streptomyces avermitilis)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏名称为FT26-9，保藏编号CGMCC No.4341，保藏日期2010年11月12日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心建议的分类命名为除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)。

本发明菌株(以下简称FT26-9)是发明人通过对阿维链霉菌MF800-6(以下简称初始出发菌株)经过紫外线复合氯化锂、亚硝基胍、羟胺、5-溴尿嘧啶诱变剂的依次诱变，然后再对诱变株进行筛选获得。该菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素A组分；其应用于阿维菌素工业生产中可提高发酵单位40％左右，降低生产成本35％左右。

本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下：

菌落颜色：灰褐色。

黑色好氧生长：生长。

菌体大小/mm：2～6mm。

适宜生长温度：27.0-28.5℃。

适宜生长pH：6.0-7.5。

菌体外表：菌落呈圆形，有褶皱，无光泽，边沿整齐。

革兰氏染色：阳性。

光吸收峰/nm：245nm。

本发明所提供的阿维菌素产生菌的制备方法，它包括以下步骤：

a、紫外线复合氯化锂诱变处理：

(1)孢子悬浮液制备：将普通阿维菌素产生菌的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁶个/毫升，于波长253.7nm，进行紫外线诱变；

(2)诱变处理：将紫外线诱变后孢子悬液系列稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，取0.1毫升各浓度的稀释液，涂在含氯化锂的平板培养基上，28±0.5℃培养7-9天。

b、诱变株的筛选：

将诱变后培养的单菌落转接至斜面培养基中，并对应点种到另一培养皿培养基上，28±0.5℃培养7天后，取单菌落菌块，用甲醇浸泡18～24小时，震荡后，测定各菌株浸取液的效价，留取10％的高效价菌株，用摇瓶发酵法进行复筛，最终挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株I；

c、亚硝基胍诱变、筛选：

(1)孢子悬浮液制备：在含有磷酸缓冲液的新鲜试管斜面内，将上述出发菌株I的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁶个/毫升，过滤，除去大部分菌丝及培养基；

(2)诱变处理：将上述孢子悬浮液加入亚硝基胍母液，使亚硝基胍含量为1.0mg/ml，充分混匀后，于28±0.5℃，220rpm振荡处理40-60分钟；诱变处理完毕后，终止亚硝基胍诱变，分别吸取0.1ml不同浓度的稀释液涂平板，28±0.5℃培养7-10天；