[发明专利]一种丙型肝炎病毒的非结构蛋白与GB病毒B的嵌合病毒

权利要求书

1.一种丙型肝炎病毒的非结构蛋白与GB病毒B的嵌合病毒，该嵌合病毒由GB病毒B的5’端非编码区及结构蛋白基因序列、丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因序列和GB病毒B的非结构蛋白4B到5B及3’端非编码区序列依次连接构成。

2.权利要求1所述的丙型肝炎病毒的非结构蛋白与GB病毒B的嵌合病毒，其特征在于，所述的丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因序列是1b基因型丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因序列。

3.一种权利要求1所述的嵌合病毒的构建方法，该方法由以下步骤组成：

(1)从1b型丙型肝炎病毒血清样本中提取出RNA并RT-PCR逆转录为cDNA，然后巢式PCR扩增丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因片段并与pMD-20T载体连接，得到含有丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因片段的质粒；其中所述巢式PCR扩增的引物如下：

上游外引物序列为SEQ ID NO：2所示的序列；

下游外引物序列为SEQ ID NO：3所示的序列；

上游内引物序列为SEQ ID NO：4所示的序列；

下游内引物序列为SEQ ID NO：5所示的序列；

(2)取GB病毒B全基因组的质粒，采用PCR方法从中扩增GB病毒B的非结构蛋白2到4A上游的EcoRI-P7和下游的NS4B-SmiI两基因片段；取步骤(1)所得到的质粒，采用PCR方法从中扩增丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因片段；其中，

扩增GB病毒B的EcoRI-P7基因片段的上游引物序列为SEQ ID NO：6所示的序列；

扩增GB病毒B的EcoRI-P7基因片段的下游引物序列为SEQ ID NO：7所示的序列；

扩增丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因片段的上游引物序列为SEQ ID NO：8所示的序列；

扩增丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因片段的下游引物序列为SEQ ID NO：9所示的序列；

扩增GB病毒B NS4B-SmiI基因片段的上游引物序列为SEQ ID NO：10所示的序列；

扩增GB病毒B NS4B-SmiI基因片段的下游引物序列为SEQ ID NO：11所示的序列；

将扩增的PCR产物分别进行电泳并凝胶回收目的条带，所得到的三段DNA用OverlappingPCR的方法，按GB病毒B的EcoRI-P7基因片段、丙型肝炎病毒的非结构蛋白2到4A基因片段和GB病毒B的NS4B-SmiI基因片段顺序进行连接，得重组DNA片段；

另取GB病毒B全基因组的质粒用EcoRI与SmiI进行双酶切，回收去除EcoRI与SmiI两位点间含有GB病毒B的非结构蛋白2到4A基因片段的DNA片段，并与所述重组DNA片段连接，得嵌合全基因组质粒；

(3)将所得嵌合全基因质粒的全基因组序列于SacI位点切断，并以其为模板，由T7 RNA聚合酶转录合成嵌合病毒的RNA。