[发明专利]一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：取正常健康成年志愿者捐献的体外外周静脉血30ml，先用生理盐水稀释后10倍，然后使用淋巴细胞分离液分离出灰白色淋巴细胞层，用PBS液对所述灰白色淋巴细胞层洗涤，在该过程中，使用台盼兰计数单个核细胞活性；

步骤二：利用TRIZOL提取经步骤一处理的灰白色淋巴细胞的RNA，利用PCR技术合成和扩增特异性MICA基因片段，KpnI 和XboI限制性内切酶切取所需要片段克隆入pEnter-3C质粒，经过序列筛选后利用Baculovirus Expression System and Gateway技术直接植入杆状病毒基因组内，重组的杆状病毒DNA转染S9f昆虫细胞，收集病毒后放入无血清的EXPRESS FIVE SFM培养基中，3天后用50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析，离心获取上清后用镍亲和力琼脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRICON 超滤器过滤；

步骤三：目标蛋白的纯化

a.二维聚丙烯酰胺凝胶电泳：将目标蛋白在IPG胶条上上样，聚焦步骤后洗涤，加SDS还原剂，连接到SDS-PAGE平板凝胶中，并以考马斯亮蓝染色，切取宽约1mm的目标蛋白条带，用50%甲醛和10%醋酸进行脱色及去除SDS；

b.串联高效液相层析：与2D-SDS-PAGE相比，它利用不同分离模式的结合，使混合物中的肽得到更大程度的分离，并且降低低丰度肽的丢失；

步骤四：MICA目标蛋白的鉴定：是MICA基因的特异性抗体，用Western Blot对MICA基因的特异性抗体Mab 1.7A8进行反向验证。