[发明专利]一种Viili胞外多糖及其制备方法

权利要求书

1.一种Viili中胞外多糖的制备方法，其特征在于：方法步骤如下：

(1)发酵：纯牛乳灭菌，按1％～3％接种量接种Viili，将接种后的牛乳置于25-35℃培养箱中，培养15～17h后取出，置于4℃冰箱中4～8h，得到发酵乳；

(2)等电点法除酪蛋白：用饱和NaOH溶液调发酵乳的pH至8.0，离心、取上清液，再用HCl调节上清液pH至4.6，再离心，再调上清液的pH至7.5；

(3)酶解：在上述上清液中加入1/6总体积的胰酶液，胰酶液浓度为2-5g/L，水浴下酶解2-3h，3000r/min，离心15min，得到酶解液；

(4)脱蛋白：以酶解液∶氯仿∶正丁醇＝30∶8∶1进行蛋白质沉淀1-3h，离心，去除沉淀，得到的滤液中无游离蛋白；

(5)乙醇沉淀：将步骤(4)所得滤液预冷，加入5～6倍体积的预冷无水乙醇，置于1-5℃冰箱中沉淀40-55h，本步骤中多糖呈絮状沉淀析出，取沉淀；

(6)透析：将经过步骤(5)得到的沉淀用截留14kDa分子量的透析袋在超纯水中透析25-30h，得沉淀物，在低于50℃下进行真空干燥，得到Viili胞外粗多糖。

2.根据权利要求1所述的Viili胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述Viili胞外粗多糖还经过以下步骤：

离子交换柱层析：将Viili胞外粗多糖用5mL蒸馏水溶解，上DEAE纤维素柱，每管4mL分管收集，洗脱步骤如下：

①使用去离子水洗脱DEAE纤维素柱，得到一种胞外多糖组分V-I，出现在第6～40管中，最高吸收峰OD值达到0.76，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来；

②使用0.1mol/L的NaHCO₃洗脱DEAE纤维素柱，得到两种多糖组分V-II、V-III，分别出现在第6～10管、第21～40管中，其最高峰OD值分别为0.45和0.12，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来；

③使用0.1mol/L的NaOH洗脱DEAE纤维素柱，得到一种胞外多糖组分V-IV，出现在第20～32管中，其最高峰OD值为0.07，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来。

3.根据权利要求2所述的Viili胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述Viili胞外粗多糖还经过以下步骤：

凝胶过滤层析：取含糖量最高的多糖V-I组分20mg用适量水溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，上Sephendex G-50柱，用去离子水平衡48h，恒流泵控制流速9mL/h，用同一去离子水洗脱，每管3mL分部收集，硫酸-苯酚法检测，收集洗脱峰部洗脱液，经真空浓缩、冷冻干燥获得白色粉状的胞外多糖纯品V-1，纯度大于99％。

4.一种Viili胞外多糖，其特征在于：由权利要求1、2或3所述Viili胞外多糖的制备方法制备得到。

5.根据权利要求4所述的Viili胞外多糖，其特征在于：所述Viili胞外多糖由鼠李糖、阿拉伯、木糖、苷露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为：7.41∶15∶8.85∶1∶3.25∶1.25。

6.根据权利要求4所述的Viili胞外多糖，其特征在于：所述Viili胞外多糖的单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在。

7.根据权利要求4所述的Viili胞外多糖，其特征在于：所述本Viili胞外多糖为纯白色或略带浅黄的粉末状固体，无味，无香气，易溶于水在热水中溶解度极大，不溶于丙酮和乙醇、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇。