[发明专利]一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法

权利要求书

1.一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1，选用绿色木霉及黑曲霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，分别得到绿色木霉及黑曲霉的二级液体种子；

步骤2，先将绿色木霉的二级液体种子用液体发酵培养基培养，按液体发酵培养基体积的8～10%接种绿色木霉的二级液体种子，28～32℃下通气培养48～72h后，再按液体发酵培养基体积的4～6%接种黑曲霉二级液体种子，28～30℃下通气培养72～96h，于接种黑曲霉后12～24h，开始连续加入补料培养基，控制还原糖含量在0.08～0.10%，直至发酵结束，将发酵液过滤即得本发明液态纤维素酶粗酶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，粗酶液可直接使用或经浓缩后使用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述斜面试管培养方法为：

将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块，置于1L水中，煮沸30分钟，8层纱布过滤，滤液中加入琼脂18克，不断搅拌至琼脂完全融化，停止加热；迅速加入20g葡萄糖，搅拌使其溶解，补足水分至1000mL，适量分装至试管或茄子瓶中，盖上棉塞，于121℃下高压蒸汽灭菌20分钟，分别划线接种绿色木霉及黑曲霉菌株，于28～30℃下培养5～7天。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，采用以下培养基：

麸皮2～4%，

（NH4）₂SO₄ 0.4～0.6%，

KH₂PO₄ 0.4～0.6%，

CaCl₂ 0.05～0.08%，

MgSO₄·7H₂O 0.08～0.10%，

其余为水；

培养方法为：培养液121℃, 灭菌3 0分钟，按4～6%接种量接种斜面试管培养得到的孢子悬液；28～30℃下，220rpm培养24～48h，得到绿色木霉及黑曲霉的二级液体种子。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述液体发酵培养基采用以下培养基：

微晶纤维素3～5%，

玉米芯2～4%，

玉米浆0.5～1.5%，

营养盐0.1～0.3%，

其余为水；

制成混合浆料，调节pH在4.5～5.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述补料培养基采用以下培养基：

微晶纤维素1～2%，

玉米芯3～5%，

玉米浆1.5～2.0%，

营养盐0.1～0.3%，

其余为水；

制成混合浆料，调节pH在5.0～6.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养盐的配方组成为：

 （NH4）₂SO₄ 4.0g/L，KH₂PO₄ 4.0 g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，Fe SO₄0.4mg/L，Zn SO₄·7H₂O 2.0mg/L，Cocl₂·6 H₂O2.0mg/L。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

二级液体种子制备：

 ⑴生产菌株 绿色木霉和黑曲霉；

⑵斜面菌种制备 制备PDA培养基，采用划线接种绿色木霉及黑曲霉菌株，在30℃下分别培养7和5天后形成大量孢子，作为种子液接种使用；

⑶二级液体菌种制备  以麸皮4%,（NH4）₂SO₄ 0.4%，KH₂PO₄ 0.6%，CaCl₂ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.08%，其余为水的液体培养基，装瓶灭菌，按4～6%接种量接种孢子悬液，30℃下，220rpm培养48h；

[4]液态发酵培养基制备

以微晶纤维素4.0%，玉米芯2.0%，0.8%玉米浆，80%水，0.2%营养盐，制成混合浆料，调节pH在4.5～5.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

[5]补料培养基制备

微晶纤维素1.0%，玉米芯3.0%， 2.0%玉米浆，80%水，0.1%营养盐，制成混合浆料，调节pH在5.0～6.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

[6]液体纤维素酶的制备

先将绿色木霉的二级液体种子，按液体发酵培养基体积的10%接种于液体发酵培养基，30℃下通气培养48h后，再接种4%黑曲霉二级液体种子，30℃下继续通气培养96h；于接入黑曲霉种子后12h，开始用补料培养基补料；发酵液还原糖含量控制在0.10%左右，直至发酵结束，将发酵液过滤即得粗酶液。