[发明专利]一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素酶是指能水解纤维素β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系，在工农业诸多领域均广泛的应用。如纤维素酶可将农作物秸秆、蔗渣等工农业废弃物生物转化为葡萄糖，再经其它微生物进一步转化为酒精、单细胞蛋白等生物化工产品。作为破乳剂，在石油开采中维持地下裂缝，保持地下压力，对地层和环境无污染。利用纤维素酶作饲料添加剂可提高饲料利用率，在医药上，利用纤维素酶和其他酶制剂配合使用，有助于纤维性物质的消化。此外纤维素酶还可用于织物抛光、废纸脱墨、茶叶加工等方面。

丝状真菌生产纤维素酶具有以下特点：纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生的纤维素酶酶系结构较为合理；同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。目前纤维素酶生产用微生物菌种多为丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉属、曲霉属和青霉属。目前公认较好的纤维素酶生产菌种为绿色木霉及其近缘菌株。

纤维素酶主要包括三类酶组分：葡聚糖内切酶（EG，endo-1,4-β-D glucanase， EC 3.2.1.4）、葡聚糖外切酶 (CBH，exo-1,4-β-D glucanase， EC 3.2.1.91 )、 β-葡萄糖苷酶 (BG，β-1,4- glucosidase ，EC 3.2.1.21)或称纤维二糖酶。在分解晶体纤维素时，任何一种酶都不能单独完成水解过程，只有三种酶共同存在并协同作用才能将晶体纤维素水解为葡萄糖。而生产高活性纤维素酶除了优化发酵工艺外，更重要的是高产菌株的选育。目前，工业上常用的纤维素酶生产菌为里氏木霉（Triohoderma  reesei）、绿色木霉（Trichoderma  viride ）、康宁木霉（Trichoderma  koningii）、黑曲霉（Aspergillus  niger）等。但在生产中常遇到以下问题：产酶活力不高；木霉生产的纤维素酶酶系组成不全，β-葡萄糖苷酶缺乏或活力极低。这些都严重影响到纤维素的酶解效率。

现今，着眼于提高纤维素酶活力及改善酶系组成的研究异常活跃，提出的方法颇多：通过基因工程构建多基因菌株同时表达多种酶组分，但成本高、耗时长；比较而言，混菌发酵则不失为一种最简单有效的方法。混菌发酵过程中混菌间互利共栖，使酶系比例协调，避免发酵过程中某一中间产物大量积累产生反馈抑制，使得混菌发酵产酶能力大大高于单一菌株，提高了产率。已有文献报道将绿色木霉、根霉混合发酵生产纤维素酶，酶活力大幅提高，但β-葡萄糖苷酶活力提高不大。针对以上不足，本发明提供一种新的混合发酵方法。

发明内容

本发明提供一种混合发酵生产高活性纤维素酶的方法。即以绿色木霉（Trichoderma  viride ）与黑曲霉（Aspergillus  niger）为纤维素酶生产菌，接种孢子液或种子液液体培养基中，通过控制培养基组成、混菌培养过程两菌生长量及培养条件、培养方式，生产高活性纤维素酶。

为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的微生物混菌发酵生产液态纤维素酶的工艺步骤如下：

步骤1，选用绿色木霉及黑曲霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，分别得到绿色木霉及黑曲霉的二级液体种子；

步骤2，先将绿色木霉的二级液体种子用液体发酵培养基培养，按液体发酵培养基体积的8～10%接种绿色木霉的二级液体种子，28～32℃下通气培养48～72h后，再接种4～6%黑曲霉二级液体种子，28～30℃下通气培养72～96h，于接种黑曲霉后12～24h，开始连续加入补料培养基，控制还原糖含量在0.08～0.10%，直至发酵结束，将发酵液过滤即得本发明液态纤维素酶粗酶液。

以上粗酶液可直接使用或经浓缩后使用。

本发明步骤1中所述斜面试管培养可以使用常规的培养方法，优选以下方法：