[发明专利]一种CAMV35S基因检测用引物、相应的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检验检测领域，具体涉及一种CAMV35S基因检测用引物、相应的试剂盒及检测方法。

背景技术

CAMV35S基因为花椰菜花叶病毒的35S启动子，广泛应用于转基因大豆、玉米、油菜、马铃薯及番茄等转基因农作物。

为了加强对转基因产品的监督和管理，目前发展了多种转基因成分检测方法，从基于蛋白质的 ELISA 检测技术到基于核酸的聚合酶链式反应（PCR）技术以及快速发展的基因芯片技术。其中 PCR 检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，这种技术通过检测转基因产品中含有的外源核酸片段来鉴定，随着荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）的出现，不仅能够进行转基因产品的定性鉴定，而且可以对转基因成分进行定量。

以 PCR 技术为代表的转基因产品检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通 PCR 技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而 Real time PCR 技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。基因芯片技术能够实现快速和高通量的检测，然而价格昂贵，检测成本高。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足转基因产品检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增（Isothermal Amplification）核酸快速检测技术是转基因产品检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplication of DNA, 简称LAMP）具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测转基因作物 CAMV35S 基因快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于根据现有诊断CAMV35S 基因中存在的成本高。设备复杂、不利于快速检测等问题，提供一种快速、简单、成本低、设备简单的CAMV35S基因检测用引物。

本发明另一目的在于提供包含上述CAMV35S基因检测用引物的试剂盒。

本发明还有一个目的在于提供一种快速检测CAMV35S基因的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明的转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因序列，选取转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因的特异性引物组，通过PCR来鉴定转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因，该引物组由如下四条引物组成：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或5所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或6所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或7所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4或8所示。

本发明的转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、Bst DNA 聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成，上述每1L反应液中含有1.6~2mmol dNTP、20~25mmol Tris-HCl、10~12.5mmol氯化钾、10~12.5mmol硫酸铵、8~10mmol硫酸镁、1~1.25ml TritonX-100、0.8~1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6~2μmol和外引物 F3/B3各0.2~0.25μmol；优选的比例是每1L反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2μmol和外引物 F3/B3各0.25μmol。

上述显色液优选为荧光染料 SYBR Green I或EvaGreen。

上述稳定液优选为石蜡油。

上述阳性对照为 CAMV35S 基因 DNA 片段。

本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺

1、将内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液无菌分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；