[发明专利]一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及华支睾吸虫的检测方法，特别是一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒。

背景技术：

华支睾吸虫病(Clonorchiasis sinensis)又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫寄生在人的肝胆管内所引起的肝胆病变为主的一种食源性人兽共患寄生虫病。曾在中国、日本、韩国、菲律宾、新加坡和马来西亚、俄罗斯等国有华支睾吸虫感染的报道。近年来，由于食物的多样化和国外饮食习惯的引入，本病在我国的感染率逐步增高，人群感人率从1～30％不等。根据全国首次寄生虫病调查表明，全国感染率平均为0.356％，以此推算，全国大约有470万感染者。其主要原因是食生鱼的习惯所致。据1988年的调查资料表明，黑龙江佳木斯地区的麦穗鱼感染率也为100％；台湾省日月潭地区，麦穗鱼、克氏鲦鱼感染华支睾吸虫囊蚴的感染率高达100％。华支睾吸虫囊蚴主要分布在鱼体的各个部分，如肌肉、头、皮、鳍及鳞等，一般以鱼肉及鱼头肉最多。除淡水鱼外，淡水虾，如细足米虾(Caridina nilotica gracilipes)、巨掌沼虾(Macrobrachium superbum)等也有囊蚴寄生，因此，水产品、特别是淡水鱼中囊蚴的检测已经成为食品安全的首要问题。

华支睾吸虫囊蚴呈椭圆形(如图1所示)，大小92μm～110μm×100μm～140μm，囊壁分两层，外壁较厚，内壁较薄。囊内有一幼虫，幼虫具口、腹吸盘、肠管和含黑色钙质颗粒的排泄囊。

当人体感染华支睾吸虫囊蚴后，可引起机体消化不良、腹泻、腹痛、肝剧痛、肝肿大、消瘦、侏儒症。在患者晚期可并发阻塞性黄疸、胆绞痛、胆管炎、胆囊炎及原发性胆管性肝癌。吸虫囊蚴直接威胁着人民的饮食安全，因此，需要一种快速、敏感、简单的检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴方法尤显十分迫切和必须。

FTA技术包含一种包埋在过滤基质中的蛋白质变性剂、螯合剂和自由基捕捉剂的特殊干燥化学试剂混合物。它对人无毒，用FTA技术收集的核酸可以在室温和高湿度环境下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是样品中感染性病原体在接触FTA时裂解失活，病原体中的核酸则被固定下来。通过简单的一步，从卡上纯化洗脱下来DNA就可以应用于下游扩增实验。FTA技术具有：①节省低温运输样品以及保存样品的低温冰箱的成本。②使有机体快速失活，避免了操作过程中样品污染的风险。③处理样品、分离得到DNA仅需15-30分钟，缩短、减少分离的步骤(4-16小时)。④样品处理只需一个简单的洗脱DNA的过程，省去了使用纯化试剂盒的花费。⑤样品需求量最小化(每个样品采集区12-40μl)因此，已广泛的用于病毒、微生物、寄生虫等生物DNA的提取。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒，所述的这种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒要解决现有技术中检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法复杂而且灵敏度不高的技术问题。

本发明提供了一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，包括一个对离体的淡水鱼样品处理的步骤、一个提取样品DNA的步骤、一个对样品的DNA进行PCR扩增的步骤和一个对PCR扩增的产物进行电泳观察的步骤；在所述的对离体的淡水鱼样品处理的步骤中，将待检测的样品加入缓冲液玻璃株匀浆打碎，然后吸取匀浆液滴在FTA卡上；在所述的提取样品DNA的步骤中，将FTA卡自然干燥，然后将FTA卡用FTA卡洗液洗涤；在所述的对样品的DNA进行PCR扩增的步骤中，将洗涤后的FTA卡晾干后放入PCR反应管中进行PCR扩增，扩增采用的上游引物为CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物为GGAAAGTTAAGCACCGACC，然后对扩增的产物进行电泳并观察。

进一步的，还包括一个对阳性的对照品进行DNA提取和PCR扩增的步骤，所述的阳性的对照品为华支睾吸虫成虫或者囊蚴。

进一步的，在所述的对PCR扩增的产物进行电泳观察的步骤中，将待检测的样品的电泳条带和阳性对照的电泳条带进行比较，如果扩增产物的长度为315bp，则表示样品中含有华支睾吸虫囊蚴，反之，则表示样品中不含有华支睾吸虫囊蚴。

进一步的，在所述的对样品的DNA进行PCR扩增的步骤中，将FTA卡裁剪后放入PCR反应管中进行PCR扩增。

进一步的，所述的FTA卡洗液为由Tris-HCl和EDTA组成的水溶液，所述的Tris-HCl在FTA卡洗液中的浓度为0.01mol/L，所述的EDTA在FTA卡洗液中的浓度为0.1mmol/L，pH为8.0。