[发明专利]鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蔬菜害虫的分子鉴定技术，特别是一种鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella(L.)又名菜蛾，方块蛾，属鳞翅目(Lepidoptera)，菜蛾科(Plutellidae)，世界各地均有分布。在我国20世纪70年代以来逐渐上升为长江流域中、下游地区十字花科蔬菜的主要害虫。小菜蛾主要为害十字花科植物，目前，对其防治以农药防治为主，物理防治和生物防治为辅。而化学防治中又以阿维菌素的使用最为广泛，主要是由于阿维菌素良好的防治效果和较低的价格决定的。阿维菌素作为一种高效经济的防治小菜蛾的药剂已经在田间使用很长时间。长期大面积反复施用必然导致小菜蛾抗药性产生，目前全国各地均有报道，其中在云南，广东等南方省份尤为严重，小菜蛾对阿维菌素抗性已经达到上千倍。为了有效防治小菜蛾，鉴定小菜蛾种群是否对阿维菌素产生抗性以及抗性程度，对于采取防治措施是否恰当非常有意义，目前鉴定小菜蛾的抗性大多通过生物测定，即采集至少300头小菜蛾，设置5-6个梯度浓度的阿维菌素，然后观察记录小菜蛾的半致死剂量。该方法比较繁琐，需要捕捉相当大数量的小菜蛾才能进行测定。

有研究表明位于小菜蛾细胞膜上的GluClα亚基是阿维菌素的作用受体之一。GluClα亚基基因的全长序列已于2008年由本实验室的梁延坡硕士克隆并且已在GenBank上登录(登陆ID＝GQ221939.1)。GluClα亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性之间的关系，以及如何利用GluClα亚基基因采用分子检测方法进行小菜蛾抗性群体的鉴定的研究，对于小菜蛾的防治及抗性种群研究具有实用价值和指导性。到目前，并未见到有有效应用GluClα亚基基因来检测抗阿维菌素小菜蛾种群的方法。

发明内容

本发明通过设计出特异性引物，运用分子生物学方法和实时荧光定量PCR方法鉴定小菜蛾种群对阿维菌素的抗性情况，仅仅需要几头待测小菜蛾即可完成鉴定，具有便捷，准确的优点。

一种鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法，步骤如下：

(1)随机捕捉5～15头待测种群的小菜蛾，分别制备每头小菜蛾的cDNA，即10个重复的待测样品；

(2)制备小菜蛾敏感种群的cDNA，即阴性对照样品；

(3)分别以待测样品、阴性对照样品为模板，进行荧光定量PCR反应；

(4)统计计算比较待测样品与阴性对照样品的荧光定量PCR反应产物产量是否具有显著差异；

其特征在于：所述荧光定量PCR采用的引物如下：

YG-S16：CGTCTACATCCGCATCTTCC，

YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。

所述小菜蛾敏感种群指对阿维菌素的半致死剂量为：0.05ug/ml以下。

所述小菜蛾敏感种群为福建敏感种群。

所述荧光PCR的反应体系如下：

cDNA 1.0ul；dNTP 2.0ul；rTaq酶0.2ul；10×Buffer 2.0ul；10uM的YG-S160.4ul；10uM的YG-A160.4ul；ddH₂O至20ul；

PCR程序：95℃，5.0min；95℃0.5min，50-60℃0.5min，72℃1min，35循环；72℃10min，4℃停止。

本发明根据梁延坡在2009提交的GluClα亚基基因序列，设计了一序列GluClα亚基基因的特异性引物，并根据特异性引物对小菜蛾抗性与GluClα亚基基因表达量之间的关系进行研究，发现GluClα亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性呈正相关。根据这一结果，发明人将选得的一对特异性引物F16结合荧光实时定量PCR技术及统计学方法提供一种坚定小菜蛾抗性种群的方法：测定小菜蛾的GluClα亚基基因表达量，并与与阴性对照的基因表达量比较是否具有显著差异，有显著差异说明待测小菜蛾为抗性种群，从而为进一步的防治手段及用药量提供指导和依据。由于本发明的方法的核心是采用分子生物学方法进行定量检测和统计，因此，在检测一个地区或一定区域的田间的小菜蛾是否为抗性种群时，仅仅需要捕捉少数几头做为检测的样品，每头为一个重复，用作荧光定量PCR的模板，不需要捕捉大量的小菜蛾用于进行阿维菌素致死剂量的测定以判断其是否为抗性种群。