[发明专利]一种猪体细胞诱变方法

权利要求书

1.一种猪体细胞诱变方法，其特征在于，步骤如下：

1)取妊娠约60天左右的猪胎儿，采用组织块培养法添加胎猪成纤维细胞培养液建立胎猪成纤维细胞系；

2)磷酸钙介导pLentiLox 3.7慢病毒表达载体及其包装组分pMDLg、pRSV REV和pVSVg在293T细胞中组建成慢病毒颗粒，12-16小时后更换新鲜293T细胞培养液，病毒包装48小时后收集含慢病毒的293T细胞培养液，经超滤浓缩后添加到胎猪成纤维细胞培养板内；

3)在胎猪成纤维细胞培养板内添加含终浓度为10μg/ml Polybrene的胎猪成纤维细胞培养液，此后，每天收集含慢病毒的293T细胞培养液，添加到胎猪成纤维细胞培养板中感染胎猪成纤维细胞2-4次；

4)将胎猪成纤维细胞培养板内的培养液更换为含胎牛血清的高糖DMEM培养液的猪诱变细胞培养液，再连续收集含慢病毒的293T细胞培养液2-4天，并让所收集的慢病毒感染胎猪成纤维细胞2-4次；

5)当胎猪成纤维细胞中的细胞形态出现集落变化后，将细胞集落经Dispase II消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，在饱和湿度培养箱中培养；经4次感染后1周在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上形成鸟巢状猪干细胞集落。

2.根据权利要求1所述的猪体细胞诱变方法，其特征在于，步骤1)所述的猪胎儿为杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿。

3.根据权利要求1所述的猪体细胞诱变方法，其特征在于，步骤2)所述的胎猪成纤维细胞培养液为含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。

4.根据权利要求1所述的猪体细胞诱变方法，其特征在于，步骤4)所述的猪诱变细胞培养液由高糖DMEM、2mM谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、1％非必须氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF、15％FBS和1％青链霉素组成。