[发明专利]一种猪体细胞诱变方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及细胞诱变技术领域，尤其涉及一种猪体细胞的诱变方法。

[背景技术]

慢病毒载体作为一类重组逆转录病毒载体在转基因生产中具有方便、快捷、高效和稳定转染等优点，目前已成为一种重要的基因转移工具被广泛应用于基因导入细胞分子生物学研究领域。慢病毒是逆转录病毒家族的成员，病毒能够利用自身组分将外源基因整合入宿主细胞基因组中，从而使外源基因随着宿主细胞的分裂增殖和传代而稳定表达。2006年人类第一次利用逆转录病毒介导小鼠皮肤成纤维细胞表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，表达这些外源基因的小鼠成纤维细胞呈现小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES)的形态和特征。来源于外源限定基因诱导的多能性干细胞具有同ES细胞相似或相同的特性，拥有二倍体生殖系嵌合遗传和四倍体互补产生后代的能力，这种细胞常被称为诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell，iPS细胞)。来自人体的成纤维细胞通过逆转录病毒载体介导表达Oct4、Nanog、Sox2和Lin 28或Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因，表达外源基因的人成纤维细胞呈现出人ES细胞的特征。在家畜方面，Esteban等2009年分别通过使用逆转录病毒或慢病毒载体介导限定因子诱导出猪的iPS细胞。由于猪在解剖学和生理学等方面同人类极为相似，因此，猪是研究人类器官移植和细胞转基因治疗等安全性和应用效率的理想动物模型和试验材料。在我们的相关试验中发现，慢病毒感染猪成纤维细胞后能够引起细胞在形态和生长性能等方面呈现特征性变化，并呈现出一些干细胞所具有的特征，这些现象的发现将会为探讨细胞的生长、发育和重构等方面提供理想的材料和手段。然而，到目前关于利用慢病毒诱导猪体细胞为干细胞的诱导技术国内外尚未有文献报道。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种利用慢病毒对猪体细胞进行诱变的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种猪体细胞诱变方法，步骤如下：

1)取妊娠约60天左右的猪胎儿，采用组织块培养法添加胎猪成纤维细胞培养液建立胎猪成纤维细胞系；

2)磷酸钙介导pLentiLox 3.7慢病毒表达载体及其包装组分pMDLg、pRSVREV和pVSVg在293T细胞中组建成慢病毒颗粒，12-16小时后更换新鲜293T细胞培养液，病毒包装48小时后收集含慢病毒的293T细胞培养液，经超滤浓缩后添加到胎猪成纤维细胞培养板内；

3)在胎猪成纤维细胞培养板内添加含终浓度为10μg/ml Polybrene的胎猪成纤维细胞培养液，此后，每天收集含慢病毒的293T细胞培养液，添加到胎猪成纤维细胞培养板中感染胎猪成纤维细胞2-4次；

4)将胎猪成纤维细胞培养板内的培养液更换为含胎牛血清的高糖DMEM培养液的猪诱变细胞培养液，再连续收集含慢病毒的293T细胞培养液2-4天，并让所收集的慢病毒感染胎猪成纤维细胞2-4次；

5)当胎猪成纤维细胞中的细胞形态出现集落变化后，将细胞集落经Dispase II消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，在饱和湿度培养箱中培养；经4次感染后1周在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上形成鸟巢状猪干细胞集落。

上述步骤1)所述的猪胎儿为杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿。

上述步骤2)所述的胎猪成纤维细胞培养液为含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。

上述步骤4)所述的猪诱变细胞培养液由高糖DMEM、2mM谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、1％非必须氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF、15％FBS和1％青链霉素组成。

本发明的有益效果是：

1)利用慢病毒对猪体细胞进行诱导，操作简单方便，诱导周期短，对慢病毒感染的胎猪成纤维细胞进行培养传代，能够分离培养出类似胚胎干细胞的鸟巢状细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，常规的冻存复苏不影响细胞的生长和形态，并且诱变的细胞核型正常，高效强表达碱性磷酸酶及Oct4、Nanog、SSEA-1干细胞特有的蛋白，在免疫缺陷鼠体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实慢病毒能够诱导胎猪成纤维细胞形成多能性干细胞；首次成功利用慢病毒诱导产生猪多能性干细胞；

2)采用慢病毒对猪体细胞的诱导和维持干细胞特征的培养液两者的有效结合建立了稳定的诱导干细胞，对未来从猪自然胚胎中分离培养建立真正的胚胎干细胞系具有重要的参考价值。