[发明专利]耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)菌株及其制备方法，尤其涉及一种表达IL-17A的重组耻垢分枝杆菌及其制备方法。 

背景技术

免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，是一种与抗原同时或预先注射于机体、能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物资，其可以增加抗原表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬、改变抗原物理性状，延长抗原作用时间、增强辅助T细胞的作用、刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞的产生、提高机体初次和再次免疫应答抗体的滴变、以及改变抗体产生类型和迟发型变态反应，并使其增强；因此，免疫佐剂在疾病的预防方面有着及其重要的作用。 

铝盐佐剂是第一个被批准用于人的佐剂，主要功能为缓释作用，同时也具备对免疫细胞的激活作用，但是铝盐佐剂与某些抗原混合注射后会引起局部炎症反应，甚至形成肉芽肿。弗氏佐剂是一种含有分枝杆菌成分的佐剂，具有较强的免疫增强效应，是应用最广泛的试验用佐剂，由于弗氏佐剂注射部位强烈的副反应，因此该佐剂目前只用于实验目的的免疫研究。 

细胞因子作为新型免疫佐剂已经在临床应用， IL-2、IFN-γ等重组卡介苗已成功应用于浅表性膀胱癌的治疗研究，如中国专利CN100360668C公开的一种分泌肿瘤坏死因子-α重组卡介苗，以及中国专利CN1710072A公开的分泌人白介素-2重组卡介苗，均能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；中国专利CN100374548C公开还公开了一种重组干扰素卡介苗菌株，在增加免疫效果的同时，还可以减少BCG用量，降低毒副作用。但是，BCG生长缓慢的特性为转基因过程带来诸多不便。 

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)是具有与BCG相似抗原的分枝杆菌，也是常用的细胞免疫佐剂，同BCG相比，耻垢分枝杆菌具有生长快、非致病性的特点，其应用范围更为广泛。目前已有多种细胞因子在耻垢分枝杆菌中得到表达，如表达TNF-α的重组耻垢分枝杆菌应用于膀胱癌，并获得较好的增强免疫应答效果(Int. J. Cancer，2004，112(4)：653-660)；如专利CN1339583A公开的重组耻垢分枝杆菌，含有人结核杆菌热休克蛋白70启动子cDNA，也可用来治疗膀胱肿瘤；专利CN101875913A公开了一种结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（CCTCC NO:M2010097）可用于预防和治疗结核病；又如表达IL-2和GLS的重组耻垢分枝杆菌可以增强小鼠抗肺结核菌感染的免疫应答(Vaccine，2007，25(4)：638-648)。但是表达IL-17A(白介素-17A，Interleukin 17A)的重组耻垢分枝杆菌尚未见有报道。 

发明内容

本发明提供了一种表达IL-17A(SEQUENCE No.4)的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) IL-17A，通过穿梭表达载体构建了一种表达IL-17A的重组耻垢分枝杆菌，并制备该重组耻垢分枝杆菌疫苗，使重组疫苗刺激固有免疫和获得性免疫应答能力得到加强，提高免疫保护效力。 

本发明耻垢分枝杆菌IL-17A已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.4446，保藏日期：2010年12月10日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；其中，表达IL-17A基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在所述耻垢分枝杆菌IL-17A中表达。 

本发明所述耻垢分枝杆菌制备方法如下： 

步骤1，依据IL-17A基因序列设计扩增引物，经PCR扩增得到IL-17A基因表达片段，然后将所述IL-17A基因表达片段克隆至载体，获得重组载体；

步骤2，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌，得到所述耻垢分枝杆菌IL-17A。

优选地，在所设计的上游引物在IL-17A基因上游引入BamHⅠ酶切位点；使所设计的下游引物在IL-17A基因下游引入Hind Ⅲ酶切位点。 

其中，所述扩增引物由5’端至3’端寡核苷酸序列优选为： 

上游引物：CAGGGATCCGCGGCTACAGTGAAGGC(SEQUENCE No.1)；

下游引物：AGTAAGCTTTTAGGCTGCCTGGCGGACAAT(SEQUENCE No.2)。