[发明专利]快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法

权利要求书

1.一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于它由以下步骤组成：

(1)构建报告基因表达载体

报告基因表达载体是在真核表达载体中同时表达报告基因和筛选基因；

上述的报告基因被分成上游片段和下游片段，在上游片段和下游片段之间插入锌指核酸酶作用位点，该插入位点距报告基因的3’端或者5’端至少为50bp；

上述的锌指核酸酶作用位点包含左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点，左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点之间包含5～7个碱基的间隔序列；

(2)构建锌指核酸酶表达载体

锌指核酸酶表达载体表达针对锌指核酸酶作用位点的一对锌指核酸酶，即左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶；

(3)构建供体载体

供体载体携带报告基因全长序列或部分序列；

部分序列与上游片段、下游两段分别具有至少50bp的同源序列；

(4)建立锌指核酸酶检测细胞系

将报告基因表达载体导入到真核细胞中，通过筛选基因的筛选，获得稳定表达报告基因的真核细胞系；

(5)检测锌指核酸酶介导的基因定点整合效率

将供体载体和锌指核酸酶表达载体同时导入到锌指核酸酶检测细胞系中，统计报告基因纠正的细胞占所有导入锌指核酸酶表达载体和供体载体细胞的比例。

2.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的报告基因表达载体是在慢病毒载体中携带两个表达框，一个表达框中表达报告基因，另一个表达框中表达筛选基因。

3.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的真核表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒载体、腺相关病毒载体中的任意一种。

4.按照权利要求1或2所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的报告基因是绿色荧光蛋白、mcherry、荧光素酶、DsRed中的任意一种。

5.按照权利要求1或2所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的筛选基因是新霉素或潮霉素。

6.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的锌指核酸酶表达载体是一个真核表达载体上同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶或者两个真核表达载体分别表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶，该真核表达载体是非整合性载体。

7.按照权利要求1或6所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的锌指核酸酶表达载体是在真核表达载体中通过可自我剪切的2A肽元件同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。

8.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的真核细胞为293细胞或U87细胞。

9.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的锌指核酸酶是锌指蛋白和IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域组成的融合蛋白。