[发明专利]快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法。

技术背景

锌指核酸酶技术是近年来发展起来的一项新的技术，通过人工设计的锌指核酸酶在基因组DNA的特定位置切割产生DNA双链缺口，继而通过细胞内源性的修复机制对断裂部位的基因进行修饰。同传统的同源重组技术相比较，锌指核酸酶技术可以使基因组靶向修饰的效率提高了10¹～10⁵。锌指核酸酶介导的基因定点修饰已经在多种体外培养的细胞中获得成功；包括人的ES和iPS细胞、植物、果蝇、爪蟾、线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠等^[2]，显示出该技术的广泛适用性，这将有力地推动基因靶向修饰技术的应用研究。

锌指核酸酶是一种由针对特定DNA序列的锌指蛋白和具有非特异性作用的FokI核酸内切酶催化结构域组成的重组蛋白。FokI核酸内切酶的催化结构域需形成二聚体才能发挥内切酶活性，因此必须由一对锌指核酸酶分别结合于由4-6个碱基间隔的DNA两条链上的靶序列上形成二聚体才能对DNA进行切割。常用的锌指蛋白由3个或4个锌指组成，一个锌指识别连续的三个碱基，因此两个锌指核酸酶共可以识别18个或者24个碱基，锌指核酸酶对DNA靶序列结合的特异性保证了对基因组DNA的特异性的切割。

锌指核酸酶的特异性取决于锌指蛋白，因此筛选高质量的锌指蛋白是获得高效特异性锌指核酸酶的关键。锌指蛋白的筛选方法经历了长时间的发展，已经相对成熟，目前主要的筛选方法有两种：一种是Sangamo Biosciences公司的专利技术，可通过sigma公司订购该服务；另一种是锌指协会开发的开放性技术平台(Oligomerized Pool Engineering，OPEN)，该平台的所有相关技术及资源都是免费开放的，使得研究人员可以筛选自己感兴趣的锌指蛋白。

目前对所筛选的锌指核酸酶的检测方法都是在细菌或酵母中进行的，其过程复杂，而且其所测定的主要是锌指核酸酶对靶位点的结合力，对其所介导的体内定点整合缺乏有效的检测方法。当前需迫切解决的一个技术问题是提供一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述锌指核酸酶检测方法的缺点，提供一种简单、快速的锌指核酸酶快速检测方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案它是由以下步骤组成：

1、构建报告基因表达载体

报告基因表达载体是在真核表达载体中同时表达报告基因和筛选基因。

上述的报告基因被分成上游片段和下游片段，在上游片段和下游片段之间插入锌指核酸酶作用位点，该插入位点距报告基因的3’端或者5’端至少为50bp。

上述的锌指核酸酶作用位点包含左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点，左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点之间包含5～7个碱基的间隔序列。

2、构建锌指核酸酶表达载体

锌指核酸酶表达载体表达针对锌指核酸酶作用位点的一对锌指核酸酶，即左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。

3、构建供体载体

供体载体携带报告基因全长序列或部分序列。

部分序列与上游片段、下游两段分别具有至少50bp的同源序列。

4、建立锌指核酸酶检测细胞系

将报告基因表达载体导入到真核细胞中，通过筛选基因的筛选，获得稳定表达报告基因的真核细胞系。

5、检测锌指核酸酶介导的基因定点整合效率

将供体载体和锌指核酸酶表达载体同时导入到锌指核酸酶检测细胞系中，统计报告基因纠正的细胞占所有导入锌指核酸酶表达载体和供体载体细胞的比例。

本发明的报告基因表达载体是在慢病毒载体中携带两个表达框，一个表达框中表达报告基因，另一个表达框中表达筛选基因。

本发明的真核表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒载体、腺相关病毒载体中的任意一种。

本发明的报告基因是绿色荧光蛋白、mcherry、荧光素酶、DsRed中的任意一种。

本发明的筛选基因是新霉素或潮霉素。

本发明的锌指核酸酶表达载体是一个真核表达载体上同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶或者两个真核表达载体分别表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶，该真核表达载体是非整合性载体。

本发明的锌指核酸酶表达载体是在真核表达载体中通过可自我剪切的2A肽元件同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。

本发明的真核细胞为293细胞或U87细胞。