[发明专利]丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫诊断技术，具体地说是一种磁微粒作为载体的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

丙型病毒性肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）引起的传染病，呈全世界分布，主要通过输血或血制品传播，近年发现丙型肝炎也多见于非输血人群，主要通过注射、针刺、含HCV血液污染伤口和其他密切接触传播，并证实也可通过母婴传播。研究表明，20%~50%的HCV感染者会发生自发性病毒清除，50%~80%感染者会持续感染，其中85%进展为慢性肝炎，10~30年后，部分慢性丙肝患者（尤其年龄较长患者）发展为肝硬化，2~10年后，可能发展为肝细胞癌。由于与慢性乙肝相比，丙肝更隐蔽，潜伏期为2~26周；症状更不明显，高达75%的感染者无任何症状，因此很容易被忽视，中国丙肝漏报率高达52%。

至今还没有研制成功可以预防丙肝的疫苗，防治丙肝只有早期进行诊断，才能在早期进行治疗并防治病情的进一步恶化，否则将会传染给他人和使自身病情加重、影响身体健康和传给后代。因此有必要开发出一种性能较好的诊断方法，能有效地在早期就将该疾病诊断出来，及时治疗，减少因丙肝带来的健康和财产的损失。

目前HCV感染的诊断实验室化验方法有：1.检测HCV抗体的血清化验；2.定量检测HCV RNA的分子试验（包括RT-PCR，TMA，bDNA）；3.基因分型技术。由于感染者体内HCV RNA水平的有限以及不稳定性，使方法2的商业化具有局限性。另外商品化的基因型确定方法已经出现，但是均未通过FDA批准，基因分型技术也未普及。HCV抗体的血清化验主要是酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA检测丙肝抗体的方法已得到了大量的推广，该方法具有很多优点，但在检测的灵敏度，稳定性等方面还有待进一步提高。全自动微粒子化学发光免疫分析是在酶免疫分析基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，与其他方法相比，这种方法有许多独特的优点，首先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了检测灵敏度；其次由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。与放射免疫法相比，磁微粒子化学发光法除具有高灵敏度、高精确度、高可靠性等优点外，还具有如下优点：a.无放射性污染，稳定性好；b.特异性高；c.试剂可随用随取，测定方便迅速，可作为急诊检测项目。根据大量的实验结果以及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，该方法逐渐成为取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首选。但是目前国内尚无生产用于丙肝抗体检测的微粒子化学发光法诊断试剂，目前急需灵敏度和特异性较高的微粒子化学发光诊断试剂，可以作为ELISA试剂和其他试剂的替代品，用于丙肝的诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床丙型肝炎病毒的辅助诊断和献血员筛查的微粒子化学发光法丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒，其包括测抗HCV磁微粒、测抗HCV示踪结合物、测抗HCV样品稀释液、质控品。其特征是：所述测抗HCV磁微粒为标记有丙肝病毒特异性重组抗原（含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）的磁性微粒子；测抗HCV示踪结合物为标记有特异性抗人IgG的异鲁米诺；测抗HCV样品稀释液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；质控品溯源至国家参考品，包括一低含量HCV抗体的血清和一高含量HCV抗体的血清。

本发明还提供了上述丙肝病毒抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：具体步骤如下：

（1）制备测抗HCV磁微粒  将带羧基磁微粒与EDC的重量比为1：2，磁微粒与丙肝病毒特异性重组抗原（即含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）比例为每毫克磁微粒标记20μg的抗原，在室温下进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭EDC的多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入含1%牛血清白蛋白的0.01MPBS，2-8℃保存；

（2）制备测抗HCV示踪结合物  特异性抗人IgG与异鲁米诺的标记，反应体系为：戊二醛最佳使用浓度为1.25%，特异性抗人IgG与异鲁米诺的最佳重量比为2：1，在室温反应1.5小时，用0.01M PBS（pH7.2-7.4）进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；