[发明专利]一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及功能基因组学和基因表达检测技术、分析技术。具体而言就是在人类功能基因组表达谱范围内筛选可用于乳腺癌转移和预后分子分型的一类基因，并建立检测技术，制备成试剂盒，应用于乳腺癌患者的转移和预后评估。

背景技术：

乳腺癌是威胁女性的恶性肿瘤之一，在过去的20年里，对肿瘤的发生机制有了更深入的理解，以手术为中心，化疗、放疗、内分泌治疗为辅助的多学科综合治疗的临床模式也得到长足的发展，使乳腺癌的复发和死亡率显著降低，但乳腺癌的诊断及治疗仍然严重依赖传统的组织病理学和免疫组化技术，缺乏能够较为准确地预测患者的复发风险并给予相应治疗的有效检测方法。

大型临床试验，如美国乳腺与肠道外科辅助治疗研究组(National Surgical Adjuvant Breastand Bowel Project，NSABP)的两项试验(B-14和B-20)回顾分析显示，雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性的乳腺癌患者可以从服用他莫昔芬和辅助化疗中获益，但是手术后单独服用他莫昔芬的患者10年内远期复发的概率仅为15％，这意味着存在大量患者接受了过度的化疗，造成了不必要的身体伤害。长久以来，临床上治疗方案的选择是以肿瘤的临床病理特征为依据，比如淋巴结的转移以及组织学分级。但淋巴结中的微小转移，以及一些重要的肿瘤特征如雌激素受体的表达和Her2的过表达等因素的不确定性，不但影响着疾病的预后，更影响着机体对治疗方案的反应。

近几年来，随着基因组学的研究深入，已发现几个能够比临床病理学指标更能准确预测肿瘤复发的多基因标记物。在美国，针对雌激素受体阳性患者的“21基因检测”已经被证实比临床病理学指标能更准确的定量评估雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性患者术后服用他莫昔芬的远期转移风险，而且可以预测他莫昔芬和CMF化疗或氨甲喋呤/5-氟尿嘧啶/叶酸化疗的疗效。

NCCN认为，临床上内分泌治疗和化疗的应用必须先权衡预期的绝对风险降低和患者个人是否愿意承受获得这些收益所要面临的毒性反应。“21基因检测”包含了更多预后/预测的生物标志物，可以再解剖分期、ER/PR和Her2状态之外提供更多预后/预测信息，从而为个体病例提供更为精确的治疗决策与预后信息，使临床医师能够选择出真正能够从内分泌或化疗中获益的患者。

ASCO乳腺癌指南提出，雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性患者可以通过“21基因检测”评估他莫昔芬治疗后的复发风险，“21基因检测”可以用于筛选那些可以从他莫昔芬治疗取得最大临床获益因而不需要进一步辅助化疗的患者。

这21个基因被分为6组，分别是增殖相关基因(Proliferation组)包括Ki-67、STK15、Survivin、CyclinB1、MYBL2；侵袭相关基因(Invasion组)包括Stromelysin3、Cathepsin L2；Her2相关基因(Her2组)包括GRB7、Her2；激素相关基因(ER组)包括ER、PR、Bcl-2、SCUBE2；其它相关基因(GSTM1、BAG1、CD68)；参考基因(ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)。

虽然该检测已被ASCO和NCCN纳入乳腺癌指南中，日本科学家Toi等报告的研究也首次表明，“21基因检测”可为雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性的亚洲乳腺癌患者提供预后信息。在国外，“21基因检测”还只是作为一种检测服务存在，严重影响了该检测在临床的开展，加之国内的关注还比较少，目前我们国内临床还没有开展这项检测。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种定量评估乳腺癌远期复发风险的试剂盒，由21对引物、21条特异性taqman荧光探针、10×RT-PCR缓冲液、2.5mM dNTP混合液、逆转录酶、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液和RNA酶抑制剂组成；

所述21对引物序列分别如下：

(1)CCNB1引物对：包括反向引物CCNB1R和正向引物CCNB1F；所述CCNB1R序列为：GCAGCATCTTCTTGGGCACA；所述CCNB1F序列为AGGTTGTTGCAGGAGACCATG

(2)Ki-67引物对：包括反向引物Ki-67R和正向引物Ki-67F；所述Ki-67R序列为：CAACTCTTCCACTGGGACGATCCG；所述Ki-67F序列为：CGGCGGACTTTGGGTGCGAC