[发明专利]聚丙烯酰胺凝胶上一种安全环保的DNA银染方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体而言，本发明涉及还原性糖在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色显影的方法，其安全环保、步骤简单、操作时间短而且灵敏度高。另外，本发明还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等

发明背景

当前，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离DNA并使DNA条带显色(可视化)，已经成为生物检测中最常用的方法之一。其中，使在聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条可视化可以采用荧光染料、可视有机染料和银可视有机染料，如亚甲蓝^[1]、亮甲酚蓝^[2]、结晶紫^[3]、和尼罗河蓝^[4，5]等，其灵敏性低而且操作耗时。染等。荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR green、和SYBR gold，该方法一方面呈现出操作简便、灵敏度相当，另一方面有表现为它们都需要昂贵的专门荧光检测仪器、一些荧光染料具有致突变作用会威胁操作者的健康、许多荧光检测结果不稳定等这些难以克服的缺点，极大地限制了它们的使用^[6-8]。而银染技术已经在广泛应用于对聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离的蛋白质的检测，它具有不可比拟的高灵敏度^[9]，也有报道银染^[10-12]能用于核酸^[13]和脂多糖^[14]的染色。

银染技术根据用含银离子的溶液浸渗中所用的试剂而分成两大类。一类被称为银氨染色法，其使用银-氨溶液来浸渗凝胶，并用含甲醛的酸性溶液来显色，但是其灵敏性低而且操作过程费时^[15]；另一类用酸性银离子溶液染色，其中凝胶浸渗在pH为弱酸性的硝酸银中，然后在碱性条件下用甲醛还原，然而其在进行核酸(DNA和RNA)检测时，要么染色灵敏度高但操作过程比较复杂^[16]，要么操作过程较简单但灵敏度不高^[17-19]，但都避免不了甲醛试剂本身对人体的健康伤害。

为此，本发明人经过长期实践研究，令人惊讶地在硝酸银染色法的基础上发明了一种以葡萄糖做为还原剂的DNA银染法，应用还原性糖代替致癌、致过敏和强挥发性的甲醛试剂，并进行方法整体的的改进，在适当提高检测灵敏性的基础上，简化步骤，仅仅在约45分钟的操作时间内就能检测到皮克(picogram)级的DNA条带(可达5pg)。另外，本发明人还发明了葡萄糖-DNA银染法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明内容

本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对核酸(以DNA为代表)染色的方法，其在检测灵敏性和操作方便程度上带来了综合性能的改善。另外，本发明的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

具体而言，在第一方面，本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其为酸性银离子染色法，其特征在于，所述方法中的银离子还原剂为还原性糖，替代甲醛作为显影成分。本发明第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA后使用，对聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带进行染色，尽管不优选，但是该方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙烯酰胺凝胶中之后使用。在本文中，硝酸银染色法本身为现有技术^[15]，其依次包括固定步骤、第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。其中，显色步骤是用甲醛溶液浸渗聚丙烯酰胺凝胶。由于本发明相对于现有技术一酸性银离子溶液染色法的显色步骤，使用还原性糖代替甲醛试剂，其中以葡萄糖效果最佳，避免了甲醛本身对操作者的健康伤害，并从整体上简化缩短方法流程。优选在本发明的第一方面，所述方法依次包括固定步骤、第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。这样，该方法在达到上述优点后还保留了现有酸性银离子溶液染色法的检测灵敏度。

在本文中，“依次”指的是所针对的步骤按其所出现的顺序执行，不能与其他步骤交换执行的顺序。优选在本发明的第一方面，所述方法依次由固定步骤、第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。