[发明专利]一种同位素标记试剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种同位素标记试剂，其特征在于：为异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂，其化学名为：[d₀]/[d₆]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯，简写为：[d₀]/[d₆]-DMPITC，其化学结构式是：其中：当X＝H时，为[d₀]-DMPITC；当X＝D时，为[d₆]-DMPITC。

2.一种权利要求1所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)将金属钠溶于无水甲醇/氘代甲醇中，配制成甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；

b)将4，6-二氯-2-氨基嘧啶溶于无水甲醇/氘代甲醇中，再逐滴滴加到现配的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在15～35℃下搅拌过夜，制得[d₀]/[d₆]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物；

c)将[d₀]/[d₆]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物溶于无水二氯甲烷中，再加入硫光气和碳酸氢钠，进行回流反应7～9小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中淬灭反应，得到[d₀]/[d₆]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯粗产品；

d)进行柱层析，得到纯化的[d₀]/[d₆]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯，即为本发明所述的同位素标记试剂。

3.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：甲醇钠/氘代甲醇钠溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。

4.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：甲醇钠/氘代甲醇钠与4，6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(2～4)∶1。

5.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：硫光气与4，6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(1.2～2.0)∶1。

6.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：碳酸氢钠与4，6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(3～5)∶1。

7.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：柱层析的洗脱液是体积比为1∶6的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂。

8.一种权利要求1所述的同位素标记试剂在多肽N端残基的鉴定分析及蛋白质的定量分析中的应用。

9.根据权利要求8所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于：是先将目标分析物分别与轻质的和重质的标记试剂反应，再进行除杂后处理，然后用氮气吹干纯化后的标记分析物，用体积比为1∶1的乙腈/水溶液溶解标记分析物，最后进行电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析。

10.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于：所述的目标分析物为N端α氨基无修饰多肽或蛋白质经过变性、酶解而得到的混合肽段或不同生理状态下的生物体蛋白质提取物。

11.根据权利要求10所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，蛋白质经过变性、酶解的操作过程如下：将蛋白质置于pH＝8.0～8.5，含有40～50mmol/L碳酸氢铵的缓冲溶液中，在1mg/ml的浓度下进行变性操作：75℃热变性10分钟；冷却至室温后，按照重量比50∶1加入胰蛋白酶，在37℃酶解12～16小时。

12.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，所述的目标分析物与标记试剂的反应条件是：在体积比为2∶2∶1的吡啶/乙醇/水的混合溶剂中，于55～60℃反应90～120分钟。

13.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，所述的除杂后处理是指将目标分析物与标记试剂的反应后溶液用氮气吹干后，用二氯甲烷萃取除去多余的标记试剂。

14.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，所述的电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析条件是：在正离子的模式下进行数据采集，流动相是体积比为(1∶1)～(7∶3)的乙腈-水溶液，检测器电压为1.7kV，碰撞气为氩气，碰撞能量为10～50％。