[发明专利]一种同位素标记试剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种同位素标记试剂及其制备方法和应用，具体说，是涉及一种异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂及其制备方法和该同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定及蛋白质比较分析中的应用。

背景技术

转化医学(Translational Medicine)(参见Clin.Sci.，2007，112，217)是应对现在医学研究日趋复杂化和与基础临床严重脱离所提出的一种研究新策略。它是不断循环、不断上升、不断深入的一种新的医学研究模式，缩短了从实验室到病床的距离，是21世纪医学发展的一个新动力。转化医学研究中的重要课题之一就是发现及监测人类疾病的新参数——生物标志物(biomarker)(参见J.Clin.Pharmacol.2003，43，329)。对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，如蛋白质和多肽。通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。而蛋白质组学技术便是发现生物标志物的重要途径。蛋白质组研究具有在整体水平上发掘与寻求潜在疾病标志物的能力，蛋白质组技术完善了以基因组学为基础的方法，集中于动态描述基因调节，其主要研究目标在于对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响以及解释基因表达调控的机制。近年来，利用蛋白质组技术检测与疾病相关标志物的研究在国内外争相报道，为疾病的临床诊断开辟了新的途径。

20世纪80年代末，电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)两种软电离技术的出现，极大的推动了蛋白质组学的发展。应用串联质谱的技术，高效率的鉴定目标蛋白的酶解肽段，进而推测蛋白质种类的“bottom up”模式被广泛应用于蛋白质组学中生物标志物的定性研究中。但是一些情况，如：非正常的碎片离子、不准确的质量、不可靠地数据库搜索方式，往往会导致错误肽段序列的产生，通过鉴定多肽N端残基，可以很好的排除假阳性以及不确定的序列，进而提升测序准确性，进而提高所鉴定的靶蛋白(生物标志物biomarker)的可靠性。目前具体主要对肽段的N端α氨基进行化学标记，并结合多级质谱的碰撞诱导裂解(collision induced dissociation，CID)专一性的诱导产生N端标记产物离子，如a₁或b₁离子。

对于a₁离子而言，Hsu等率先采用N端肽的双甲基化的标记方法，研究了衍生肽段在二级质谱中的a₁离子信号(参见J.Proteome Res.，2005，4，101)。而另一种广泛应用的是异硫氰酸苯酯(PITC)的标记方法(参见J.Mass Spectrom.1997，32，225)，该试剂通过在串联质谱中诱导肽段发生气相埃德曼(Edman)裂解，从而生成b₁离子，在N端氨基酸测序和MRM定量中都有较好的应用。但是，以往的手段仍存在一些缺陷，如：标记后产物质谱信号下降，标记效率低下，某些肽段因为不能产生明确的N端离子，而得出错误的结果。此外，N端同分异构残基(亮氨酸、异亮氨酸)也不能够很方便的鉴定。

发明内容

针对上述现有技术的不足之处，本发明的目的之一是提供一种可以加快标记反应速率、提高标记肽段的信号、有利于增强鉴定肽段的准确性和可信性的同位素标记试剂；本发明的目的之二是提供所述同位素标记试剂的一种制备方法；本发明的目的之三是提供所述同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定及蛋白质比较分析中的应用。

本发明提供的同位素标记试剂，为异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂，其化学名为：[d₀]/[d₆]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯，简写为：[d₀]/[d₆]-DMPITC，

其化学结构式是：其中：当X＝H时，为[d₀]-DMPITC；当X＝D时，为[d₆]-DMPITC。

本发明所述的同位素标记试剂的制备方法，包括如下步骤：

a)将金属钠溶于无水甲醇/氘代甲醇中，配制成甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；