[发明专利]肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，其特征在于它包括：

(1)扩增EGFR基因18，19，20，21外显子的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示引物对；

(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9～12所示；

(3)亲和素标记的磁珠；

其中，SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7在其5’端标记生物素；

在一次检验中共同使用。

2.根据权利要求1所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：购自QIAGEN公司；

(2)反应液：PCR Buffer，引物SEQ ID NO：1～12，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μLTaqDNA聚合酶；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。

3.肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所得DNA为模板，扩增EGFR基因18，19，20，21外显子序列片段；

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；

(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；

(5)测序得到SNP突变频率。

4.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因18外显子序列片段的方法如下：

PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：50.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。

5.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因19外显子序列片段的方法如下：

PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：20.3μL，SEQ ID NO：60.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。

6.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因20外显子序列片段的方法如下：

PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：30.3μL，SEQ ID NO：70.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。

7.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因21外显子序列片段的方法如下：

PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：40.3μL，SEQ ID NO：80.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。