[发明专利]肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属分子病理诊断领域，具体涉及一种用于准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR突变的方法。

背景技术

肺癌危害性大且致死率高，目前是全世界癌症死因的第一名，1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年，肺癌中75％～80％为非小细胞肺癌。晚期肺癌病人采用放、化疗等治疗手段不仅降低了生存质量，且疗效不佳。易瑞沙(Iressa，即吉非替尼Gefitinib)是目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物，为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase inhibitors，TKI)，临床试验证实对东方人(亚洲人为主)、女性、非吸烟者、肺泡细胞癌或腺癌患者的疗效较好。进一步的研究表明，非小细胞肺癌患者EGFR基因(NG-007726)上18，19，20，21外显子上的突变状态与易瑞沙治疗效果显著相关，其中携带18，19，21外显子的突变型的非小细胞肺癌患者对易瑞沙治疗效果明显好于非突变型患者，而携带20外显子上的突变型则对易瑞沙耐受。

目前，测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准，但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高，一般大于50％，并且突变率低于20％的核苷酸突变，不能有效检测和判读，因此会造成假阴性。相比于测序技术，其它分子生物学检测方法，如荧光定量PCR，高效液相色谱技术等，存在结果不能准确定量等问题，因此会导致假阳性或假阴性。

Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。相比传统测序技术和荧光定量PCR检测方法，降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织，低肿瘤细胞含量仍可检测)，具有更高的灵敏度，可定量检测低至1％的突变，准确性高，更适合于高通量分析，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有无可比拟的优势。

本发明通过对EGFR基因型序列分析，设计了特异的生物素标记引物，利用PCR和焦磷酸测序技术，准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR外显子突变频率。该方法可快速准确的定量基因型频率，其重要意义在于：(1)指导肺癌患者有针对性用药，避免无效用药；(2)改善预后；(3)避免获得耐药；(4)降低对样本组织的取材要求；(5)减少医疗费用。对以EGFR为靶点的靶向药物，如易瑞沙，仅对EGFR突变基因型(18，19，21外显子)有效，EGFR20外显子突变基因型会导致耐药，因此，启动靶向治疗前应进行突变检测。未经靶点检测或检测结果假阴性或假阳性而盲目用药不仅可能导致高额的经济损失，还可能会贻误宝贵的治疗时机，甚至导致病情恶化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR外显子突变检测试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，它包括：

(1)扩增EGFR基因18，19，20，21外显子的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示引物对；

(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10SEQ ID NO：11SEQ ID NO：12所示；

(3)亲和素标记的磁珠；

其中，SEQ ID NO：4SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6SEQ ID NO：7在其5’端标记生物素；

在一次检验中共同使用。

上述肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，具体包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：购自QIAGEN公司；