[发明专利]一种芝麻愈伤组织诱导、分化和植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以芝麻幼胚为外植体诱导愈伤组织并分化形成再生植株的技术方法，属于生物技术领域。

背景技术

芝麻属于植株再生较困难的作物。我国开展芝麻组织培养技术研究已有近30年的历史，国内公开报道的芝麻愈伤组织诱导分化技术不具有重复性，且很少采用幼胚作为外植体，诱导出的愈伤组织质量较差，造成分化不成功。至今在我国有关芝麻愈伤组织分化及植株再生的组织培养技术体系一直未真正建立，这也影响了以此技术为基础的芝麻转基因技术体系的发展。因此，当前急需探讨一种芝麻愈伤组织诱导、高效分化及植株再生技术方法，为芝麻的无性快速繁殖和芝麻转基因技术的建立提供技术支撑。

发明内容

本发明目的在于提供一种芝麻愈伤组织诱导、分化和植株再生的方法。

为实现本发明目的，采取如下技术方案：

1、幼胚外植体的获得及预培养

选取在大田生长的开花后12-19天芝麻蒴果，在超净工作台上，先用70％酒精处理30s，再用3％次氯酸钠处理15min，然后用无菌水冲洗3-5次，之后在显微镜下剥取发育正常的芝麻幼胚，接种于幼胚生长培养基(MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)上，作为外植体预培养1周。培养条件为：温度25±2℃，光照强度3000-5000lx，光照/黑暗时间为16h/8h。

2、愈伤组织的诱导及分化

将以上预培养后的外植体放在愈伤组织诱导培养基(MS培养基+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+2mg/L 6-BA(6一苄基嘌呤)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)上，一周后，可以看到在外植体伤口处长出愈伤。培养到第三周左右观察可以发现愈伤组织变紧表层有茎芽小突起，一个月后可见愈伤组织上有绿芽点长出。

3、再生植株的获得

等到绿芽点继续发育成绿色不定芽及芽丛时，切取丛生芽放于芽增殖培养基(1/2MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)，两周后可以看到绿芽长出短轴茎而形成苗且根系发达。

以上所有组培养基灭菌前用氢氧化钾或氢氧化钠调pH值，灭菌后pH值处于5.6-5.9之间。

本发明创新点在于：该方法以芝麻幼胚为外植体，利用筛选出的愈伤组织诱导和分化培养基配方，获得高质量愈伤组织并成功分化最终形成完整植株。技术重复性好，植株获得效率高。

本发明优点在于：本发明以幼胚为外植体获得胚性愈伤组织并成功分化最终形成完整植株，解决了我国芝麻组织培养技术中的愈伤组织分化及再生这一关键问题和难题，是芝麻组织培养和转基因技术研究中的一个重要创新。采用该方法可以获得高质量愈伤组织及组培苗，为芝麻快速繁殖和转基因技术奠定了技术基础，促进我国芝麻组织培养技术的发展。

附图说明

图1是剥取的芝麻幼胚外植体；

图2是从幼胚外植体诱导出的愈伤组织；

图3是已出现芽点分化的愈伤组织；

图4是带有丛生芽的愈伤组织；

图5是由丛生芽形成的小植株；

图6是已生根的组培苗。

具体实施方式

为对本发明进行更好的说明，结合附图举实例如下：

实施例1.芝麻豫芝11品种的愈伤组织诱导、分化和植株再生方法

1、选取在大田生长的开花后12天芝麻(豫芝11品种)蒴果，在超净工作台上，先用70％酒精处理30s，再用3％次氯酸钠处理15min，然后用无菌水冲洗3.5次，之后在显微镜下剥取发育正常的芝麻幼胚，接种于幼胚生长培养基(MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)上，作为外植体预培养1周。培养条件为：温度25±2℃，光照强度3000-5000lx，光照/黑暗时间为16h/8h。如附图1。

2、将预培养后的外植体放在愈伤组织诱导培养基(MS培养基+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+2mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)上培养。一周后，可以看到在外植体伤口处长出愈伤(见附图2)。培养到第三周左右观察可以发现愈伤组织变紧表层有茎芽小突起，一个月后可见愈伤组织上有绿芽点长出(见附图3)。

3、继续培养直到绿芽点继续发育成绿色大的不定芽及芽丛(见附图4)。切取丛生芽放于芽增殖培养基(1/2MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)上进行再生植株培养(见附图5)，两周后可以得到根系发达的豫芝11芝麻无性繁殖组培苗(见附图6)。

以上所有组培培养基灭菌前用KOH(氢氧化钾)调pH值，灭菌后pH值处于5.6-5.9之间。以上所有操作均在超净工作台上完成。