[发明专利]一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法无效
| 申请号： | 201110023524.9 | 申请日： | 2011-01-16 |
| 公开（公告）号： | CN102585010A | 公开（公告）日： | 2012-07-18 |
| 发明（设计）人： | 董贵俊 | 申请（专利权）人： | 董贵俊 |
| 主分类号： | C07K17/08 | 分类号： | C07K17/08;C07K19/00;C07K14/50;C07K16/22;C07K1/22;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/63 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 250102 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 检测 重组 碱性 纤维 细胞 生长因子 rhbfgf 免疫 胶乳 及其 制备 方法 | ||
1.一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球，其特征在于，该免疫微球由抗hbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小50nm，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R2＝0.83。
2.一种权利要求1所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：
(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长人bFGF(hbFGF)基因表达序列；
(2)将人bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；
(3)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-hbFGF融合蛋白；
(4)利用凝血酶切割GST-hbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获得人bFGF；
(5)将佐剂溶合抗原(GST-hbFGF融合蛋白)后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗hbFGF多克隆抗体；
(6)将鼠抗hbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组hbFGF蛋白的免疫胶乳微球。
3.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤2中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-3-hbFGF。
4.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤3中的亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B。
5.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤4中的亲合层析柱为Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow。
6.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤6中的微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基。该微球的活化是首先用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。
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