[发明专利]一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球，及其该微球的制备方法。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)广泛存在于神经组织、成纤维细胞、巨噬细胞中，作为人体一种广谱有丝分裂原，具有极强的生物活性：①对来源于中胚层和神经外胚层的各种细胞均有促增殖作用、趋化作用和促细胞迁移运动作用；②能促进剖面毛细血管新生，改善了微循环和组织的营养状况，同时促进成纤维细胞、成肌细胞的增殖，使肉芽迅速生长；③增强源于中胚层的免疫细胞的活性，提高剖面的抗感染能力。研究表明，bFGF在体内参与多种组织的创伤修复过程，是体内重要的创伤愈合因子之一。创伤后bFGF的含量高低能直接反映创面修复中的血管生成水平，为检测和监测创伤修复和组织愈合情况等提供依据。

在临床上，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可用于治疗颅脑、脊髓、周围神经损伤，中毒，感染，脑出血，脑梗塞，脑萎缩，脑发育不良，角膜溃疡，神经性耳聋，面瘫，粘膜、皮肤损伤，烧伤，慢性溃疡，软组织损伤，内脏损害，骨折，一些内分泌疾病，断肢再植和各种手术后的伤口愈合等。bFGF可以促进损伤愈合，大大缩短病程，改善预后，但迄今对于损伤创面中原发bFGF含量的检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关bFGF免疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、快速的新型免疫检测技术和产品。

发明内容

本发明的目的在于：进一步填补bFGF免疫检测技术的研发空白，从而提供一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明的一种用于检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球，其特征在于，该免疫微球由抗hbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小50nm，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R²＝0.83，如图1所示。

本发明的一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：

(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长人bFGF(hbFGF)基因表达序列；

(2)将人bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；

(3)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-hbFGF融合蛋白；

(4)利用凝血酶在柱切割GST-hbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获得人bFGF；

(5)将佐剂溶合抗原(GST-hbFGF融合蛋白)后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗hbFGF多克隆抗体；

(6)将鼠抗hbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组hbFGF蛋白的免疫胶乳微球。

所述步骤2中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-3-hbFGF。

所述步骤3中的亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B。

所述步骤4中的亲合层析柱为Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow。

所述步骤6中的微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基。该微球的活化是首先用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。

本发明的优点在于：本发明的一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法，采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用化学偶联方法偶联抗hbFGF多克隆抗体获得，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均匀，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R²＝0.83。

本发明的目的、特征及优点将通过优选的实施例结合附图加以说明。

图面说明

图1是羧基化聚苯乙烯微球扫描电镜照片

图2是hbFGF基因原序列