[发明专利]一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)挑选400-600株经紫外诱变的黑曲霉单菌落；(2)初筛；(3)复筛；(4)摇瓶验证实验；其中，以邻甲基苯基-α-D-葡萄糖苷作为所述初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物，所述邻甲基苯基-α-D-葡萄糖苷如结构式(I)所示：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷的合成路线为：二环己基碳二亚胺在吡啶催化下与羧酸作用产生酰化活性中间体，α-D-葡萄糖经该中间体乙酰化，与邻甲氧基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得底物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)依次包括以下步骤：

a)对步骤(1)挑出的单菌落采用96孔板30-32℃培养55-72h，装液量为200-270μL，同时以未经诱变的菌株做对照；

b)向96孔板中移入10-20μL发酵液；加入0.1-0.25％的底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷40-60μL，30-32℃温浴10-15min后，加入80-100μL 2.5-3.0moL/L的NaOH溶液终止反应；向对照组中移入10-20μL发酵液，并加入80-100μL同浓度NaOH溶液，温浴10-15min后再加入所述底物；

c)取100-120μL重氮盐溶液加入酶反应体系中，混匀，室温显色2-5min后，于450nm处酶标仪测定，同时以蒸馏水为空白对照，测定发酵后各发酵液600nm处的吸光值。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中96孔板培养的培养基包括：麦芽浸粉2.5-3.5g/L，玉米浆3.2-4.5g/L，K₂HPO₄0.15-0.25g/L，KH₂PO₄0.3-0.45g/L，MgSO₄·7H₂O0.010-0.025g/L，NH₄NO₃0.3-0.6g/L，培养基pH 5.0-6.0。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中发酵液的成分中含有α-葡萄糖苷酶。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中重氮盐溶液制备过程为：取0.2-0.35g/L NaNO₂80-110mL，然后加入3moL/L的HCL 4.5-6.5mL，30-32℃温浴4-6min，加入50g/I的苯胺8-12mL，30-32℃反应5-8min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是对初筛得到的高产菌株进行试管复筛；所述复筛是以未经诱变的菌株为对照。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)是对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵验证实验；所述摇瓶发酵验证实验是以未经诱变的菌株为对照。