[发明专利]一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的高通量筛选方法。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase E C 3.2.1.20)是水解酶类，属于键专一性酶，它可专一性地切开糖类底物分子中非还原端的α-1，4糖苷键，个别种类的α-葡萄糖苷酶可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷键，释放出葡萄糖。因此，一般来说，α-葡萄糖苷酶对底物要求不甚严格，具有广泛的底物专一性。在低聚异麦芽糖的生产中，利用α-葡萄糖苷酶的水解作用和α-葡萄糖苷转移酶的转苷作用是生产低聚异麦芽糖的关键。将α-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶共固定化后制成生物传感器可快速高效检测麦芽糖，从而应用于食品成分分析，医学诊断和环境分析等方面。因此α-葡萄糖苷酶倍受国内外食品工业界的重视。

α-葡萄糖苷酶大多属于微生物酶，生物细胞产生各种酶的总量很多，但每一种酶的含量很低。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，国内研究主要以粗酶液为主，而且国内所用菌株产酶能力也较弱，因此选育高产菌株非常必要。

诱变筛选过程中由于正突变的几率很低，要在筛选过程中避免错筛和漏筛，就需要建立快速高效准确的筛选方法。而原有方法存在灵敏度差，底物价格昂贵，反应时间较长等因素，制约了其在大规模筛选高产α-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株方面的应用。而本发明在α-D-葡萄糖还原端设计结合上邻甲氧基苯基基团合成邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷，并以该化合物作为诱变筛选时酶分解的底物，达到了准确快速高通量筛选的目的。

发明内容

本发明提供了一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)挑出400-600株经紫外诱变的黑曲霉单菌落；(2)初筛；(3)复筛；(4)摇瓶验证实验；其中，使用邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷作为初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物，所述的邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷如结构式(I)所示：

其中，所述底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷的合成路线为：二环己基碳二亚胺在吡啶催化下与羧酸作用产生具有酰化活性的中间体，α-D-葡萄糖经该中间体乙酰化，与邻甲氧基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得底物。

本发明中，所述步骤(2)依次包括以下步骤：

a)对步骤(1)挑出的单菌落采用96孔板30-32℃培养55-72h，装液量为200-270μL，同时以未经诱变的菌株做对照；

b)向96孔板中移入10-20μL发酵液；加入0.1-0.25％的底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷40-60μL，30-32℃温浴10-15min后，加入80-100μL 2.5-3.0moL/L的NaOH溶液终止反应；向对照组中移入10-20μL发酵液，并加入80-100μL同浓度NaOH溶液，温浴10-15min后再加入所述底物；

c)取100-120μL重氮盐溶液加入酶反应体系中，混匀，室温显色2-5min后，于450nm处酶标仪测定，同时以蒸馏水为空白对照，测定发酵后各发酵液600nm处的吸光值。

本发明中，步骤a)中所述96孔板培养的培养基包括：麦芽浸粉2.5-3.5g/L，玉米浆3.2-4.5g/L，K₂HPO₄0.15-0.25g/L，KH₂PO₄0.3-0.45g/L，MgSO₄·7H₂O 0.010-0.025g/L，NH₄NO₃0.3-0.6g/L，培养基pH 5.0-6.0；所述步骤b)中发酵液的成分中含有α-葡萄糖苷酶。

本发明中，步骤c)中所述重氮盐溶液制备过程为：取0.2-0.35g/L NaNO₂80-110mL，然后加入3moL/L的HCL 4.5-6.5mL，30-32℃温浴4-6min，加入50g/L的苯胺8-12mL，30-32℃反应5-8min。

本发明中，所述步骤(3)是对初筛得到的高产菌株进行试管复筛，所述复筛是以未经诱变的菌株做对照。

本发明中，所述步骤(4)是对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵验证实验，所述摇瓶发酵验证实验是以未经诱变的菌株做对照。