[发明专利]一种乙型肝炎病毒表面抗原的检测试剂及检测方法

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂是以水溶性A₃B型金属卟啉标记乙肝病毒表面抗体HBsAb得到的的金属卟啉标记HBsAb，所述的水溶性A₃B型金属卟啉如式(I)所示：

式(I)中R为n为0～6的自然数。

2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的式(I)中n为0。

3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂按如下方法制得：将N-羟基琥珀酰亚胺加入浓度为5mg/mL的水溶性A₃B型金属卟啉水溶液中，在10～30℃下搅拌10～30min，然后加入含有HBsAb的水溶液，继续在10～30℃下搅拌3～5h，反应产物在0～10℃下离心分离两次，合并上清液并用硫酸铵进行盐析，将盐析后的沉淀用pH 7.0～7.5的磷酸盐缓冲液透析1～3h，至透过液为无色，冷冻干燥，从而分离出金属卟啉标记的HBsAb，即为乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂；所述的含有HBsAb的水溶液中HBsAb的质量以N-羟基琥珀酰亚胺质量计为0.1～0.5mg/mg，含有HBsAb的水溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL。

4.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂检测HBsAg的方法为：

(1)将HBsAb包被于固相载体上，制成包被HBsAb的微孔板，所述固相载体为96聚苯乙烯微孔板；

(2)取步骤(1)制得的包被HBsAb的微孔板，分别加入HBsAg标准品和待检测的HBsAg样品，经过4℃放置过夜或37℃孵育30～60min，使待测样品和标准品中的HBsAg分别与HBsAb结合，洗涤，除去未结合的HBsAg，得到结合HBsAg标准抗原的微孔板和结合HBsAg待测抗原的微孔板；

(3)加标记抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂用磷酸缓冲液配制成浓度为1.0～5.0μg/mL检测试剂溶液，将步骤(2)得到的结合HBsAg标准抗原的微孔板和结合HBsAg待测抗原的微孔板中分别加入体积为200μL所述的检测试剂溶液，37℃孵育30～60min，洗板，得到结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg标准抗原微孔板和结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg待测抗原微孔板；

(4)检测：于步骤(3)得到的结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg标准抗原微孔板和结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg待测抗原微孔板中分别加入新鲜配制的发光底物工作液，10～30℃静置5～10min，检测420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度；所述发光底物工作液为0.1～0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼50～100μL和质量浓度为0.1％～1.0％过氧化氢50～100μL。

5.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂检测HBsAg的方法中所述的发光底物为0.1mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼和质量浓度1.0％过氧化氢。

6.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂检测HBsAg的方法按以下步骤进行：

(1)包被：用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液与HBsAb水溶液配制1.0～2.5μg/mL的HBsAb包被液，每孔100μL加入96聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜或37℃放置30～60min，弃包被液，每孔加入200μL含1％～5％牛血清蛋白的所述磷酸盐缓冲液作封闭液，37℃封闭1～2h，用pH7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次，30℃下真空干燥后放入封闭袋中真空保存，制得包被HBsAb的微孔板；所述HBsAb水溶液中HBsAb的浓度为1.0～5.0mg/mL；

(2)加样：将步骤(1)制备的包被HBsAb的微孔板分成标准品组及待测样品组，在标准品孔中加入50μL、浓度分别为10ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0.156ng/mL和0.0ng/mL的HBsAg标准品，在待测样品孔中加入50μL预处理的待测样品，用封板膜封住反应孔，4℃放置过夜或37℃孵育30～60min，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次，所述的待测样品的预处理为3000r/min离心30min，取上清；

(3)加标记抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂用磷酸缓冲液配制成浓度为1.0～5.0μg/mL的检测试剂溶液，于步骤(2)的标准品孔及待测样品孔中分别加入所述的检测试剂溶液100μL，37℃孵育30～60min，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次；

(4)检测：于步骤(3)的标准品孔及待测样品孔中分别加入新鲜配制的发光底物工作液，10～30℃静置5～10min，检测420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度；所述发光底物工作液为0.1～0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼100μL和质量浓度0.1％～1.0％过氧化氢100μL。