[发明专利]丙型肝炎病毒检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒，特别是一种从血液中检测其是否带有丙型肝炎病毒的试剂盒。更确切讲，本发明是利用利用环介导等温扩增技术(LAMP)而研发的从人血液中进行检测丙型肝炎病毒(HCV)的检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎(hepatitis C，HC)是上世纪70年代中期发现的一种新型肝炎，当时被命名为输血后非甲非乙型(NANB)肝炎。其病原体丙型肝炎病毒(HCV)直一到1989年才通过分子克隆技术被发现，也是至今唯一在未分离到病原体之前通过分子克隆技术发现的人类病毒。丙型肝炎是人类特有的一种复杂的肝脏疾病，全球约有1.7亿丙型肝炎病毒(HCV)感染者，每年因HCV感染而死亡人数高达28万人，其致病因子是丙型肝炎病毒(HCV)。HCV是一种有包膜的RNA病毒，含有一条长约9600个核苷酸的单股正链RNA分子。HCV基因组的特征与黄病毒科中的黄病毒属和瘟病毒属十分相似，因此，HCV被纳入黄病毒科，单独分为丙型肝炎病毒属。HCV基因组的5′和3′端非翻译区的核苷酸序列高度保守，含有顺式作用元件，主要负责调控病毒蛋白的翻译及病毒基因组的复制。相反，HCV基因组的开放阅读框(open reading frame，ORF)序列在不同的病毒株中高度变异。根据核苷酸序列的变异程度，HCV被进一步分为HCV1-HCV7七个主要基因型和多个亚型。该病在全世界范围内流行，并且只感染人，主要是通过被感染的血液和血液制品而被感染人的。

丙型肝炎病毒(HCV)感染最显著的临床特征通常无明显症状，大多数感染者转为慢性病毒携带者，大约有10％-30％感染者能成功地清除掉病毒感染，但是大约70％的感染患者持续出现并发症，并可能最终演变成肝硬化及原发性肝细胞癌。

HCV的病毒基因组包括5′端非翻译区、一个编码3010～3040个氨基酸多肽的开放阅读框(open reading frame，ORF)和长度可变的3′端非翻译区。HCV蛋白首先被翻译成一条蛋白多肽，然后经细胞和病毒蛋白酶切割而成10个不同的病毒结构蛋白和非结构蛋白，依次为C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B，另外一种由核心蛋白编码区经核糖体移码翻译而成的新蛋白，被命名为F或ARFP蛋白，其生物学特性和功能仍不清楚。HCV结构蛋白包括核心蛋白(C)、包膜蛋白E1和E2，另外p7是一个大约7KDa的疏水性小蛋白，是否存在于病毒颗粒中仍不清楚。HCV非结构蛋白包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它们在病毒细胞感染周期中主要负责病毒蛋白质的切割和RNA的复制。NS2编码23kDa的疏水性的Ⅲ型跨膜蛋白，其功能是负责在NS2与NS3蛋白之间的顺式切割；NS3编码大约70kDa的蛋白，具有多种酶活性，与NS3下游区域所有蛋白的切割和HCV的慢性感染有关；NS4A是NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，同时可协助病毒RNA复制体的膜附着；NS4B是27kDa大小的疏水性跨膜蛋白；NS5A是一种磷酸化蛋白，主要以分子量56kDa和58kDa形式存在。

丙型肝炎病毒的实验室诊断技术包括检测抗-HCV抗体的ELISA或放射免疫诊断(RIA)技术和检测丙型肝炎病毒核酸的PT-PCR、实时定量PCR和转录介导扩增(TMA)技术。ELISA或放射免疫诊断(RIA)技术检测血清中抗HCV抗体，不宜作为急性丙型肝炎的常规实验室诊断方法，因为它们检测的既不是中和抗体，也不是lgM抗体，而是lgG抗体，同时它们具有不够灵敏和非特异性的特点，一些自身免疫性慢性肝病患者可出现假阳性，需要其他技术辅助诊断。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，用于检测人血液中HCV的试剂盒，同时提供这种试剂盒的使用方法。

本发明的丙型肝炎病毒快速检测试剂盒中有四条特异性引物，这四条特异引物为：外侧引物：

上游F：5-GGTGAGTACACCGGAATTGC-3，

下游B：5-(CACGGTCTACGAGACCTCC-3；

内测引物：

FIP：5-GGCACGCCCAAATCTCCAGGTTTTAGGACGACCGGGTCCTT-3，

BIP：5-GCGAGACTGCTAGCCGAGTTTTTCCCTAT CAGGCAGTACCACA-3。