[发明专利]一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法

说明书

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法。

背景技术：

土贝母系葫芦科植物土贝母(Bolbostemma paniculatum)的干燥鳞茎。广泛产于河南、河北、山西、山东、甘肃、宁夏、陕西、青海、云南等地，是一种传统中药，载于清代赵学敏氏编著的《本草纲目拾遗》。古代用它的块茎来治疗乳岩、乳痈、乳腺增生和瘰疬等疾患，临床上显示出明显的散结毒、消痈肿效果。

土贝母苷甲是从土贝母中提取分离得到的自然界首例糖链以环状结构连接的皂苷，具有免疫抑制、抗病毒、抗肿瘤、杀精等多种活性。黄霈等研究发现土贝母苷甲(TBMS1)呈浓度依赖性显著抑制Bewo细胞的生长；流式细胞术分析显示TBMS1能促进细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G1期，并导致线粒体跨膜电位降低，细胞色素c(Cyt c)释放，caspase-3表达增强；DNA梯状区带验证了药物诱导细胞凋亡的发生；Bax表达上调，Bcl-2及磷酸化的p38表达下调等结果表明，TBMS1可能是通过p38/MAPK信号通路调控作用，导致线粒体功能紊乱，从而影响凋亡相关基因表达，有效诱导Bewo细胞凋亡。于立坚等发现土贝母苷甲可明显抑制HUVECs的生长，其抑制效果与剂量和作用时间相关，另外还有明显的抑制血管生成活性，其抑制血管生成作用与诱导血管内皮细胞凋亡，抑制其运动能力，下调VEGF、bFGF和PDGF的表达有关。苷甲抑制人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞的粘附、侵袭和迁移能力，其对PGCL3细胞的侵袭和粘附的影响可能与其降低PGCL3细胞MMP-2的分泌量及其活性，降低PGCL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率有关。苷甲有快速激活MAPK的效果，激活MAPK信号转导通路可能是苷甲诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一。土贝母皂苷甲、丙能够诱导SW480细胞凋亡，这可能是土贝母皂苷抗肿瘤作用的又一途径。微管是构成细胞骨架的重要组成成分，是肿瘤细胞的特定靶成分，实验表明土贝母皂苷、苷甲具有一定的抗微管作用，从而诱导癌细胞的凋亡。

目前尚未见有高纯度土贝母苷甲制备的文献和专利报导。为了能满足市场上对土贝母苷甲的需求，我们研究并总结发现了一种操作简单、产品纯度高、从土贝母中分离纯化土贝母苷甲的方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法，得到的土贝母苷甲纯度大于95％。

本发明所提供的一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法，包括以下步骤：

(1)将土贝母材料粉碎，采用50-90％乙醇或甲醇提取，合并得提取液；

(2)上述提取液加入活性炭和硅藻土脱色，将脱色液减压浓缩至干，得固形物；

(3)将上述固形物加水溶解，上非极性大孔树脂柱吸附2次，依次用水和60-80％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压回收试剂得土贝母总苷；

(4)将土贝母总苷经制备型HPLC色谱分离，乙醇/水、乙腈/水或甲醇/水为流动相洗脱，流速2-10ml/min，根据色谱图分段收集目标流分，回收溶剂后得土贝母苷甲粗晶；

(5)将上述粗晶采用两相溶剂进一步纯化得高纯度产品，再用高效液相色谱仪对其纯度进行检测。

所述步骤(2)活性炭和硅藻土加入量为提取液的0.5-1.5％(W/V)，活性炭和硅藻土比例为2-5∶1。

所述步骤(3)中大孔树脂可选D101、HPD100、X-5等非极性大孔吸附树脂。

所述步骤(4)流动相中乙醇-水体积比为30-60∶40-70、乙腈-水体积比为30-45∶55-70、甲醇-水体积比为68-80∶20-32。

所述步骤(5)所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇。

本发明的有益效果是，利用本分离提纯方法，可快速从土贝母中提取分离得到高纯度的土贝母苷甲；整体工艺操作简单、产率高、产品纯度好，适合工业化生产。本发明为土贝母苷甲的进一步开发利用提供药理原料、理论和实践支持。

具体实施方式：

实施例1：