[发明专利]检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学、分子生物学和生物制品领域，尤其是一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法。

背景技术

西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）为黄病毒科黄病毒属( Flavivirus)，为单股正链RNA病毒，表达的蛋白可以分为 10 个单独的蛋白结构:3 个结构蛋白 ,囊膜蛋白( E) 、 膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(C) ,以及 7 个非结构蛋白 NS1、 NS2A、 NS2B、NS3、 NS4A、 NS4B 和 NS5结构与登革病毒等黄病毒相似。西尼罗病毒感染人体以后可以引起一种称之为“西尼罗热”的急性传染病。这种病毒可以引起高热、头痛、肌肉疼痛、皮疹、淋巴结肿大等症状，可侵犯中枢神经系统，产生脑膜脑炎症状，严重者危及病人生命。目前尚无有效的治疗方法和疫苗接种,因此该病一旦暴发流行极易引起人们的恐慌,已构成全球性公共卫生的新威胁。西尼罗病毒感染的主要流行地区是非洲、北美洲、欧洲，但近年来，印度、马来西亚、泰国、菲律宾、土耳其、以色列、印度尼西亚、巴基斯坦等我国周边的国家相继出现，并有向我国传入的趋势，加强西尼罗病毒传入的监测和防范工作非常必要，尤其需要加强出入境人员、动物的感染监测以及出入境血液制品、生物制品等生物物质检测工作，并尽快调查国内动物血清学感染情况。因此，急需建立一种快速、简便的西尼罗病毒诊断方法。

目前，国内建立的检测WNV抗体的方法有PCR、TaqMan RT2PCR、NASBA、SYBR Green RT-PCR 等核酸检测，病毒分离培养，补体结合实验，血凝抑制实验等等。上述技术和方法虽然可以检测WNV及其抗体水平，在实践中也取的一定的效果，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，常限于实验室内进行，很难普及和推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，内设置有包被西尼罗病毒样颗粒的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液，cutoff血清，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，洗涤液，TMB底物溶液和终止液。

进一步，所述西尼罗病毒样颗粒是通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，蔗糖梯度离心结合超速离心纯化，获得西尼罗病毒的VLPs。

进一步，所述样品稀释液为的 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液；所述洗涤液为含0.1%吐温-20的0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液，所述终止液为2M硫酸溶液。

利用上述试剂盒间接ELISA诊断人西尼罗病毒的方法，具体为：

1）      被检测血清、cutoff血清、标准阳性血清和标准阴性血清都用血清稀释液作1:100稀释后，按酶标板加样模式每孔加入100ul，37度放置1h；

2）      倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

3）    每反应孔加入辣根过氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0.5h，倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

4）      每个显色孔加显色底物100ul，室温放置15min；

5）      每个显色孔加终止液50ul终止反应；

6）      用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光光。

进一步，所述方法检测样本的判定标准为：每板、或同一板的孔条或孔检测时，必须包括cut-off校准样和两个对照样，判定结果以待测样本OD₄₅₀值与cutoff OD₄₅₀值比值P/C，大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性，介于1.3-1.5之间为可疑，须重检，重检时P/C值大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性。

本发明应用哺乳动物细胞表达系统表达的西尼罗病毒样颗粒为包被抗原建立了ELISA方法，由于病毒样颗粒(VLPs)是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，而且具有与天然病毒同样的构象和抗原表位，因此对人不具有感染性，稳定性好，不易失活，有较高的安全性，免疫原性更接近天然病毒。本发明为检测人西尼罗病毒IgG抗体提供一种安全，特异，敏感，快速，操作简单，经济的试剂盒，为预防和控制西尼罗病毒从国外入我国方面提供了技术手段和方法。

附图说明