[发明专利]一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体

权利要求书

1.一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，包括下述步骤：

(1)、内源基因靶位点的选择：根据内源基因序列特异性选择二聚体ZFN识别并结合的靶位点；

(2)、构建穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A；

(3)、将步骤(1)中的二聚体ZFN插入步骤(2)中构建的ZFN腺病毒表达载体pAdTrack-CMV-T2A中，得到目的质粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN；取Pme I内切酶线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-easy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN；

(4)、腺病毒包装，得到ZFN腺病毒；

(5)、步骤(4)得到的ZFN腺病毒转染哺乳动物细胞。

2.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于：所述步骤(1)中二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列，其中左边ZFN编码的序列如SEQ ID NO.1所示，右边ZFN编码的序列如SEQ ID NO.2所示；二聚体ZFN识别并结合的靶位点序列为SEQ ID NO.3所示的5’-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGG-3’，其互补链序列为3’-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5’。

3.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的构建是通过在pAdTrack-CMV系统的多克隆位点SalI和XhoI之间插入T2A剪切肽，使得多克隆位点区变为Acc 65I、KpnI、ScaI、SalI、T2A剪切肽、ClaI、MluI、BstBI、XhoI和Bgl Ⅱ，所述pAdTrack-CMV系统的序列如SEQ ID NO.7所示，所述T2A剪切肽的序列如SEQ ID NO.5所示，所述穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的序列如SEQ ID NO.4。

4.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于：所述步骤(3)中重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN的制备是将SEQ ID NO.1所示的左边ZFN编码序列插入到SEQ ID NO.4所示的穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的KpnI和SalI两酶切位点之间，将SEQ ID NO.2所示的右边ZFN编码序列插入到SEQ ID NO.4所示的穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的ClaI和XhoI两酶切位点，得到目的质粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN；取Pme I线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-easy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中重组，于LB+30μg/mL kanamycin的固体培养基上37℃培养过夜，提取质粒，Pac I酶切鉴定，得到序列如SEQ ID NO.6所示的重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN。

5.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于：步骤(4)所述的腺病毒包装是指重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN经用Pac I内切酶处理后，用脂质体2000将Pac I内切酶线性化的质粒pAd-T2A-ZFN转染293细胞，进行腺病毒包装，得到重组ZFN腺病毒。

6.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于：步骤(5)所述的腺病毒转染哺乳动物细胞是指用ZFN腺病毒感染Hela229，得到细胞株Hela229-ZFN。

7.权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的二聚体ZFN，其特征在于：所述二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列，其中左边ZFN编码的序列如SEQ ID NO.1所示，右边ZFN编码的序列如SEQ ID NO.2所示，所述二聚体ZFN识别并结合的靶位点序列为SEQ ID NO.3所示的5’-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGG-3’，其互补链序列为3’-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5’。