[发明专利]一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体。

背景技术

传统的基因靶向修饰依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，特异性不高，效率也非常低，通常为10^-6级，增加了实际操作中的工作量，限制了这些技术的应用。由于在人体细胞内同源重组的效率特别低，通过单纯的同源重组实现人类基因组的永久修复是不切实际的，这也严重阻碍了生物医学的研究和安全有效的基因治疗的进展。

锌指核酸酶(ZFNs)技术是新近发展起来的一种可用于动植物转基因、人类遗传疾病基因治疗以及微生物基因组改造的新兴技术。锌指核酸酶是一种人工合成酶，此酶含有两个功能性结构域：锌指蛋白构成的DNA结合域和非特异性核酸酶构成(Fok I)催化域。这种核酸酶就像一把剪刀，可识别特异的DNA位点并切割DNA，通过细胞内固有的DNA双链断裂修复机制，在导入引入外源基因的前提下，达到在该位点插入外源基因，或者将该位点的基因敲除的目的。目前该技术以其高效性和特异性受到高度重视。近几年来，已经有多篇研究成果在NATURE、SCIENCE等杂志上发表。这一技术的特异性和高效性已经在果蝇、植物细胞和人类细胞中得到验证。

哺乳动物细胞对锌指核酸酶产生的DNA双链切口(DSB)具有自我修复功能，修复的方法有同源重组(HR)和非同源重组末端连接(NHEJ)两种。应用同源重组(HR)修复机制的情况下，可以在该位点插入一个外源基因，产生转基因细胞(KNOCK-IN)；应用细胞固有的非同源重组末端链接(NHEJ)机制的情况下，细胞在修复断裂的DNA双链时，需要去掉断口处几个核苷酸，从而导致该基因阅读框的改变，从而实现该基因定向敲除(KNOCK-OUT)。

目前对锌指核酸酶转基因技术的研究主要集中在国外，国内尚未见相关报道。 2006年，Kelly Beumer等利用锌指核酸酶对果蝇的生殖细胞基因组的y和ry位点定向打靶，发现诱导后的生殖细胞形成的亲本几乎都发生了突变，而且这些亲本的后代有25％的新突变体，大部分的新突变体都有通过同源重组插入的带有标记基因的目的基因。这表明锌指核酸酶在果蝇生殖细胞定向打靶中具有高效性和特异性。2008年Yannick Doyon在斑马鱼ntl基因敲除的研究中，将锌指核酸酶的mRNA注入斑马鱼的单细胞胚胎，成体后在锌指核酸酶的识别位点上发生了高效率的突变，且出现了预期的特定性状消失现象，ntl基因的平均突变率为20％。利用锌指核酸酶对斑马鱼基因敲除的高效性和特异性说明，这种方法可以应用于斑马鱼或其他生物基因组任何位点的敲除，前提是将锌指核酸酶的mRNA注入生物体的受精卵中，且能稳定表达。通过不断的探索和改进，目前锌指核酸酶技术已经成功应用于各种动植物的基因敲除或转基因研究中。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中由于常规转基因过程中位置效应和插入失活等原因导致的动物转基因技术的瓶颈问题—内源基因无法定向敲除和外源基因无法高效定向导入的问题提供了一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体。。

本发明的技术方案如下：

一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，包括下述步骤：

(1)、内源基因靶位点的选择：根据内源基因序列特异性选择二聚体ZFN(锌指核酸酶)识别并结合的靶位点；

(2)、构建穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A；

(3)、将步骤(1)中的二聚体ZFN插入步骤(2)中构建的ZFN腺病毒表达载体pAdTrack-CMV-T2A中，得到目的质粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN；取Pme I内切酶线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-ea sy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN；

(4)、腺病毒包装，得到ZFN腺病毒；

(5)、步骤(4)得到的ZFN腺病毒转染哺乳动物细胞。