[发明专利]酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法

权利要求书

1.酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）根据酿酒酵母S.cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:1~2所示；

（2）以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤（1）所述引物进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWIN1上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；

（4）培养重组大肠杆菌至OD₆₀₀值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液，离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；

（5）将步骤（4）得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于步骤（2）中，所述PCR扩增的反应条件为：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s和72 ℃ 10 min，其中，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环26次。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于步骤（5）中，所述自切割反应前/后的洗脱所用的缓冲液配方为20 mmol/L的Na-HEPES、0.5 mol/L的NaCl和1 mmol/L的EDTA。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于所述缓冲液体积为20 ml，pH为7.0。

5.根据权利要求1所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于步骤（5）中，所述自切割反应的温度为25 ℃，反应时间为25 h。