[发明专利]酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种可高效表达、纯化酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的方法。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类低分子量、高半胱氨酸含量(约占氨基酸总量的30%)、不含芳香族氨基酸的小分子金属结合蛋白。它广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌、细菌等中。1957年，Margoshes和Vallee在研究镉的生物学作用时，首次从马肾中发现含镉MT。迄今大量研究表明，MT能被多种因素诱导产生，在吸附重金属离子、调节微量元素（如Zn、Cu）代谢、清除自由基、拮抗电离辐射等方面发挥着十分重要的作用。同时，MT的产生还与老年性痴呆症、Wilson病、肿瘤发生发展等密切相关。因此，对MT的理论和实际应用研究具有广阔的前景。

酿酒酵母（S.cescerevisiae）金属硫蛋白由61个氨基酸残基组成，相对分子质量为5700，在N端有一段由8个氨基酸组成的信号肽。酿酒酵母金属硫蛋白在体内经过加工去掉N端的信号肽，成为成熟肽后，才具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。酿酒酵母MT与人体MT结构相近，且酵母MT对自由基的清除能力比动物组织的MT更强。许多学者通过金属离子诱导的方法从酿酒酵母中获得MT，但产量不高，无法很好的应用于工业生产。运用基因工程技术可以帮助人们获得高产量的目的蛋白，要获得具有生理活性的MT需要解决在工程菌中切除N端信号肽，简化产物纯化步骤等问题。目前关于使用基因工程技术在工程菌中高效表达酿酒酵母MT的报道很少。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽产量不高，需要解决切除信号肽、简化产物纯化步骤等问题，提供一种简单高效的表达纯化酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明的技术思路是利用原核表达质粒pTWIN1便捷的产物纯化方法，将目的基因与pTWIN1载体相连，构建重组质粒后转入工程菌中，表达得到的融合蛋白中含有能与几丁质高效结合的CBD结构域，和能够在特定温度和pH条件下发生自剪切作用的内含肽intein。将融合蛋白经几丁质柱高效亲和纯化，并经特定温度和pH诱导后发生独特的在柱自剪切作用，洗脱后即可获得纯化的目的蛋白。

本发明酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法包括如下步骤：

（1）根据酿酒酵母S.cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:1~2所示；

（2）以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤（1）所述引物进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWIN1上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；

（4）培养重组大肠杆菌至OD₆₀₀值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液，离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；

（5）将步骤（4）得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。

作为一种优选方案，上述方法中，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s和72℃ 10min，其中，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s循环26次。

作为一种优选方案，上述方法中，步骤（5）中，所述自切割反应前/后的洗脱所用的缓冲液配方为20mmol/L的Na-HEPES、0.5mol/L的NaCl和1mmol/L的EDTA；更进一步地，所述缓冲液体积为20ml，pH为7.0。

作为一种优选方案，上述方法中，步骤（5）中，所述自切割反应的温度为25℃，反应时间为25h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

酿酒酵母金属硫蛋白在体内需要经过加工去掉信号肽，成为成熟肽后，才具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。要获得具有生理活性的MT需要解决在工程菌中切除N端信号肽，简化产物纯化步骤等问题。

本发明直接表达酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽，无需在工程菌中切除金属硫蛋白N端的信号肽，表达产物已具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。