[发明专利]生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒

权利要求书

1.一种生物发光快速检测特种致病菌使用的检测方法，其特征在于利用免疫磁珠上的单克隆抗体或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应捕获菌悬液或者待测试样中的致病菌，然后加入微生物裂解液释放细菌内的三磷酸腺苷，最后通过荧光素-荧光素酶检测ATP含量，以判断样品中是否存在特定致病菌，并通过ATP标准曲线的测定来推测含有特定致病菌的数量。

2.根据权利要求1所述的方法，特征在于按照下述步骤进行：

(1)标准ATP曲线的制作

对ATP标准品进行等比稀释，浓度范围在10^-12～10^-7mol/L，加入生物发光剂进行检测，获得ATP标准品浓度与其发光值之间的关系曲线；

(2)待测样品的预处理

按照不同样品的性质参照国标对待测样品进行相应的预处理，制备成体积为0.2-10ml的样品溶液；

(3)特异性致病菌的磁珠富集

将免疫磁珠加入到待测样品溶液中，共孵育30-100min，充分反应后，磁分离除去上清液；

(4)致病菌裂解

在步骤(3)所述的待测样品中加入10-100μl微生物裂解液，室温作用1-5min。

(5)ATP生物发光测试

在步骤(4)所述的溶液中加入检测缓冲液50-200μl，加入生物发光试剂50-100μl，然后立即置发光检测仪中测定发光值；

(6)试样中相应致病菌ATP含量的计算

根据步骤(5)测定的发光值和步骤(1)中所得的标准曲线，推算样品中相应的ATP浓度和致病菌数量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包被抗体的免疫磁珠按照1ml计，含有1-100μg的单克隆抗体或者多克隆抗体、0.1-1mg的聚合物修饰的超顺磁Fe₃O₄或者γ-Fe₂O₃纳米颗粒和含有1-10mg牛血清白蛋白和吐温80的缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的微生物裂解液按 照体积百分比计，含有0.5-5％的三氯乙酸、十二烷基三甲基溴化铵、曲拉通、二甲亚砜、苯甲烷胺中至少一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于检测缓冲液包含1-20mM可溶性无机镁盐和三羟甲基氨基甲烷，缓冲液的pH＝7.6-7.8。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于生物发光剂按照lml计，含有0.01-5mg的荧光素、0.001-1mg的荧光素酶、0.5-10mg的牛血清白蛋白、0.5-10mg海藻糖和pH为7.6-7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

7.由权利要求1-3、5或6中任一项所述的方法配套构建的试剂盒，其特征在于具体由包被抗体的免疫磁珠0.1-5ml、ATP标准品500-500μm、微生物裂解液1-100ml、生物发光试剂1-50ml、检测缓冲液10-500ml组成。