[发明专利]生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒，更确切地说本发明利用生物发光法快速检测微生物总量或者特定微生物数量的方法及检测试剂盒，属于微生物检测领域。

背景技术

快速检测和识别致病菌不管是在临床诊断方面，还是在食源性致病菌监测方面，甚至生物武器防察方面都是当今社会的一个重要议题。食源性致病微生物种类繁多，缺乏灵敏、便捷、特异的快速检测技术，是食品安全和人民健康无法得到有效保障的主要原因之一。由于缺乏有力的监测技术，据WHO报告，世界各国食源性疾病报告的发病率不到实际发病率的10％。因此开发针对致病菌的快速、灵敏、可靠的检测方法和现场、便携的检测仪器和配套试剂，是食品安全、人民健康和国家安全保障的迫切需要。

水和食品中细菌的检测，特别是致病性细菌的检测，对于控制传染病、保护环境卫生和人民群众身体健康都有着重要的意义。目前水体菌落总数测定采用国标平板计数法即37℃恒温培养24h，因为这种方法结果可靠，被视为微生物检测的金标准。但是，传统的微生物培养法耗时长、步骤繁琐、需要多种培养基和试剂，无法满足当今社会一些突发事件对微生物现场快速检测的迫切需求。ATP生物发光法是近年来发展最快的定量微生物检测分析技术之一，具有快速、简便、灵敏等特点，主要是通过间接测定活菌总数来监测样品清洁度或卫生状况。

生物发光计数法利用ATP与虫荧光素-荧光素酶(Luciferin-Luciferase)复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。荧光素酶在镁离子存在的条件下，与还原荧光素和ATP结合形成荧光素酶-荧光素-单磷酸腺苷的复合物，该复合物与氧结合时发出荧光：

实质上，虫荧光素酶促进的生物发光反应，使用了ATP分子内的化学能，激发了荧光素氧化脱羧作用，然后产生发光。萤火虫荧光素酶几乎唯一以ATP为特异的底物，来自自然界其它核苷的影响可被忽略发光试剂于饱和量下，每一ATP分子能释放出一个光子，因此光子的数量与ATP含量成正比。发出的光及ATP含量可使用相对发光强度(RLUs)来衡量，这些单位均可直接使用，而不必计算具体的ATP量或菌落形成单位(CFUs)。光子的数量可采用ATP荧光仪进行测量。

ATP生物发光法存在的首要问题是灵敏度有时达不到卫生学要求。从灵敏度角度讲，ATP生物发光法要求样品中细菌浓度最低不少于1000CFU/ml，但这种灵敏度有时达不到卫生学要求，需要一定时间的预培养。而免疫磁分离技术是一种行之有效的浓缩方法，可以将细菌数浓度提高10倍甚至100倍，从而节省了预培养的时间，大大缩短检测时间。因此将ATP生物发光法与免疫磁分离技术结合起来，检测大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌，将具有快速、特异性好、灵敏度高等特点，在食品、环境、化工、医药等领域将有广阔的发展前景。

本发明针对目前饮用水和食品监测和控制中缺乏快速、灵敏、可靠检测致病菌的现状，本发明拟采用生物发光法结合免疫磁分离技术实现快速检测总菌和目标致病菌，为后期开发的便携式生物传感器提供配套的试剂。

发明内容

本发明的目的是提供生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒，本发明提供了一种快速检测特定食源性致病菌数量的方法，建立特异性的生物发光检测试剂盒，为卫生监督和食品安全提供可靠保障。

本发明提供的快速检测微生物数量的试剂盒，包括包被抗体的免疫磁珠、微生物裂解液、荧光素酶及保护剂、检测缓冲液等试剂。检测方法是利用生物发光法结合免疫磁珠识别特种致病菌，具体是利用免疫磁珠上的单克隆抗体或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应捕获菌悬液或者样品中的特异性致病菌，然后加入裂解液释放细菌内的三磷酸腺苷(ATP)，最后通过荧光素(D-Luciferin)-荧光素酶(Luciferase)检测ATP含量来判断样品中是否存在特定致病菌，并通过ATP标准曲线的测定来推测含有特定致病菌的数量。

(1)本发明提供的生物发光检测特种致病菌使用的检测方法的检测步骤是：

a)先制作标准ATP曲线，即对ATP标准品进行等比稀释，浓度范围在10^-12-10^-7mol/l。加入生物发光剂进行检测，得到ATP标准品浓度与其发光值之间的关系曲线。

b)然后参照国标方法对样品进行预处理，制备成体积为0.2-10ml的样品溶液。