[发明专利]不对称还原制备(R)-1,3-丁二醇的方法及菌株

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株产羰基还原酶新菌株——克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)ZJB 09162，及其在催化不对称还原4-羟基-2-丁酮制备(R)-1，3-丁二醇中的应用。

(二)背景技术

(R)-1，3-丁二醇，又可记作(R)-1，3-BDO(结构见式(I))，是一种无色粘稠状，带甜味液体，能与水、乙醇、丙酮、丁酮等混溶。(R)-1，3-丁二醇是一种具有广泛用途的重要手性砌块，如在医药领域用于合成碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮，在农药领域用于合成杀虫剂和信息激素，同时它也是合成一大类香料的重要中间体。因此，开展(R)-1，3-丁二醇合成研究具有重要的实际应用价值。

(R)-1，3-丁二醇的化学合成主要有两条工艺，一是以L-苏氨酸为起始原料，在KBr存在下先亚硝化脱氨，再经甲酯化、氢解脱溴和还原等4步反应制备(R)-1，3-丁二醇。该工艺原料成本高，有毒有害原辅料用量大，收率低(仅为64％)(Synth Commun，1991，21(22)：2295-2300)。二是以4-羟基-2-丁酮为底物，经钌基催化剂Ru-BINAP一步不对称加氢还原(US，4981992，1991)，但该催化剂制备成本高，且回收利用困难，难以实现规模化生产。

生物转化法制备光学纯手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性高等优点，代表着绿色化学的发展方向，已成为制备手性化合物的经典方法。生物催化合成手性化合物有以下两种途径：一是利用微生物或酶对外消旋混合物中某一个异构体具有高度的立体选择性，而对另一个异构体不起催化作用(或作用很小)，从而实现对映体分离，拆分为两个具有光学活性的对映体；二是从潜手性醛或酮等羰基化合物前体出发，通过不对称催化反应得到光学活性化合物。

目前国际上生物法制备(R)-1，3-丁二醇的报道主要来自日本大赛璐化学工业株式会社，公开了Candia parapsilosis、Candia utilis、Candidaarborea、Kluvermyces lactis、Issatchenkia scutalata、Rhodococcuserythropolis等多种能够催化(R，S)-1，3-丁二醇手性拆分或4-羟基-2-丁酮不对称还原制备(R)-1，3-丁二醇的微生物(J Mol Catal B：Enzyme，2001，11：513-521，Biosci Biotech Biochem，1993，57(2)：348-349，JP 03236795，WO 9207082)。Yamamoto等进一步将Candia parapsilosis IFO 1396仲醇脱氢酶基因在E.coli JM109中重组表达，以该重组菌为生物催化剂拆分外消旋1，3-丁二醇，产物(R)-1，3-丁二醇光学纯度95％，转化率48.4％(Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(4)：925-927)。该工艺具有一定的工业化应用价值，但产物的光学纯度有待提高。Eguchi等采用固定化SP382脂肪酶(Candida sp.)催化双酰化反应动力学拆分(R，S)-1，3-丁二醇，经一次拆分后光学纯度达到85％以上，将该产物化学水解为二醇后，再次进行双酰化拆分，光学纯度达到98％以上(Biotech Lett，15(9)：955-960)。该工艺需经2次酰化和1次水解反应，步骤繁琐，且需要酰基化供体，原子经济性低。

综上所述，与化学合成工艺相比，生物催化法合成(R)-1，3-丁二醇具 有显著的优势，显示出广阔的应用前景。但是生物拆分工艺也存在诸如原料利用率低(50％以上的1，3-丁二醇无法利用)，及已报道的拆分用醇脱氢酶立体选择性不高等缺陷，导致总收率低，产物光学纯度难以达到药物合成的高要求(e.e.＞99％)。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株能够高立体选择性地催化不对称还原反应的产羰基还原酶菌株，以及一种利用该羰基还原酶催化4-羟基-2-丁酮不对称还原生成高光学纯度(R)-1，3-丁二醇的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明采用的技术方案是：

一株产羰基还原酶菌株——克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ZJB09162，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010335，保藏日期：2010年12月6日。