[发明专利]大黄鱼脂肪细胞体外培养方法

权利要求书

1.大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于依次包括以下步骤：

1）、取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；

2）、将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；

3）、将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；所述完全培养基为含20%胎牛血清培养液；

4）、原代培养：将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。

2.根据权利要求1所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于：待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，进行传代接种培养。

3.根据权利要求1或2所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤2）的细胞分散处理包括以下内容：

A、将脂肪组织切成小块，用双抗PBS浸泡、冲洗；得冲洗后小块组织；

B、将冲洗后小块组织悬浮于0.2%胶原酶II消化液中，在22～28℃恒温摇床中消化0.8～1.2小时；所述0.2%胶原酶II消化液为按照0.2g胶原酶II与100ml的PBS相混合所得；

C、在步骤B所得物中加入与0.2%胶原酶II消化液同体积的完全培养基，以中和消化液；然后依次通过220～280μm尼龙膜和80～120μm尼龙膜，收集滤液；

D、将上述滤液离心，弃上清，加入PBS冲洗；得大黄鱼前体脂肪细胞。

4.根据权利要求3所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤2）的B中：每1g的冲洗后小块组织悬浮于4～6ml的0.2%胶原酶II消化液中。

5.根据权利要求4所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述含20%血清培养基配方为：DMEM/F12培养基， 20%标准胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素， 3.7g/L NaHCO₃， 2mM L-glutamine。

6.根据权利要求5所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤4）为：将细胞悬液在血细胞计数板上计数，以5×10⁴个细胞/cm²的密度接种于事先用鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，然后放在细胞培养箱中进行培养，培养条件为：25℃，5%CO₂。

7.根据权利要求6所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述传代接种培养为：

①、待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，先用胰蛋白酶消化液在24～26℃下消化2～3min，然后用与胰蛋白酶消化液同体积的完全培养基终止消化， 1000rmp/min离心5min，得沉淀；将沉淀与完全培养基按照1：3的体积比进行传代接种培养；在此培养过程中，每2～3天更换一次完全培养基；

②、待细胞达到70～80%汇合时，重复上述步骤①。