[发明专利]一种基因芯片及其检测方法

权利要求书

1.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片的基质膜上固定有6种特异性探针；所述特异性探针分别为禽流感病毒探针、狂犬病病毒探针、猪链球菌2型探针、炭疽菌探针、沙门氏菌探针、大肠杆菌O157探针。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述禽流感病毒探针序列如SEQ NO.1所示；所述狂犬病病毒探针序列如SEQ NO.2所示；猪链球菌2型探针序列如AEQ NO.3所示；沙门氏菌探针序列包括3条，分别如SEQ NO.4~6所示；炭疽芽胞杆菌探针如SEQ NO.7所示；大肠杆菌O157探针序列包括3条，分别如SEQ NO.8~10所示。

3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述特异性探针的5’端标记15-30 Poly T。

4.根据权利要求1所示的基因芯片，其特征在于，所述基质膜为硅晶片、玻璃或高分子。

5.一种如权利要求1所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、在GenBank上分别选取禽流感病毒的M1基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌O157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2.0设计特异性探针；

S2、合成特异性探针；

S3、使用DR. Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥10min；每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；

S4、用紫外交联仪照射基因芯片7~10分钟，照射能量为1.2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。

6.根据权利要求5所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述S2步骤还包括：在特异性探针的5’端标记15-30 Poly T，以使特异性探针很好固定在基质膜上。

7.根据权利要求5所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH₂O。

8.一种使用如权利要求1所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、检测病原特异性引物设计：在GenBank上分别选取禽流感病毒的M1基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌O157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2.0设计病原特异性引物；并在病原特异性引物对的上游引物标记生物素biotin；

S2、核酸提取：使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板；

S3、进行PCR或RT-PCR扩增：根据待测样品的个体和疾病类型，进行不同的检测项目，并选择扩增方法和试剂盒；

S4、杂交：取S3步骤的PCR或RT-PCR扩增的产物各10~20μL与200μL的DR.杂交缓冲液充分混合，沸水变性6min，迅速转移至冰上10min；将上述混合物转移至基因芯片室内，平铺均匀，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47℃；弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加0.2μL Strep-AP和200μL封闭液的混合液，室温反应30min，弃去封闭液，以DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分；

S5、显色：每个基因芯片室加4μL NBT/BCIP和196μL DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-10min，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止；

S6、读取结果：利用芯片反应仪扫描读取结果。

9.根据权利要求8所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，所述S3步骤中，猪链球菌2型、炭疽菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌，使用TaKaRa PCR Amplification试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行PCR扩增，反应条件为94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，72℃ 10min，35个循环；禽流感病毒、狂犬病毒，使用TaKaRa One Step RT-PCR试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行RT-PCR扩增，反应条件分别为50℃ 30min，94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，72℃ 10min，35个循环。