[发明专利]鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法

说明书

技术领域

本发明属于兽医学，具体涉及鹿布氏杆菌病的血清检测诊断方法 

技术背景

布氏杆菌病是由布氏杆菌感染引起的世界范围内的重要人畜共患传染病。它的危害程度极大，不仅影响人们的身体健康，阻碍畜牧业的发展，还可造成严重的经济损失。 

鹿布氏杆菌病是由布氏杆菌引起的一种鹿的慢性传染病，本病主要侵害生殖系统，致使母鹿发生流产和乳腺炎，公鹿发生睾丸炎和附睾炎。自1940年鹿布氏杆菌病被首次确立以来，鹿的布病广泛发生于世界各地，给养鹿业带来了严重的经济损失。据国外报道，鹿布氏杆菌病在一些鹿群的感染率高达50％～60％，个别鹿群甚至更高。目前，有关鹿的布病的特异性诊断方法尚未缺乏研究。 

近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光(IFA)和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法(Enzyme-Linked  Immunosorbent Assay，ELISA)，本试验方法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。 

酶联免疫吸附试验法以其灵敏度高(可达ng甚至pg水平)，特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用，它已迈出医药、临床领域，步入农业、渔业、畜牧业和食品加工业。 

1976年，Cavleson等首次应用ELISA方法检测牛布氏杆菌抗体并发现其敏感性比试管凝集试验(SAT)高10～20倍后，许多学者相继应用ELISA对人、牛等动物的布氏杆菌病抗体检测进行了研究，结果均表明：ELISA比传统的SAT、补体结合试验(CFT)敏感，且特异性高。 

目前，对鹿的布病检测，还停留在平板和试管凝集试验等常规的血清学方法上，并以家畜判定标准作为鹿的判定标准。其特异性，敏感性，重复性和用ELISA方法检测牛等动物布氏杆菌病抗体所得的结果相比较，差距很大。说明以往的鹿的布病检测，仍停留在较低的水平。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，用于鹿布氏杆菌病诊断，提高相对现有技术的诊断水平。 

本发明的检测方法所用生物材料包括：作为抗原的布氏杆菌猪型2号苗(S₂)、酶标抗体兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清： 

本发明的检测方法检测步骤包括： 

1、抗原包被 

在酶标板上选待检血清、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、酶标抗体对照、抗体对照孔及底物对照七种用途的培养孔；将经超声波粉碎的布氏杆菌猪型2号苗用抗原稀释液按疫苗比稀释液1∶12.5-1∶50的比例稀释。等量加入试验孔、阳性血清对照孔、阴性血清对照孔及抗原对照孔中，在兔抗鹿IgG-HRP对照孔、抗体对照孔及底物对照孔中加入与前述抗原液等体积的浓度为50mg/ml的牛血清白蛋白，之后将酶标板置35℃-42℃温箱孵育2-4h； 

2、洗涤 

取出酶标板，甩去微孔中的溶液，向全部待检血清孔和对照孔等量加入洗液，加入量为将孔加满为止，之后室温(15-25℃)下放置3min，后倒掉，如此反复三次，空干(简称3×3’)； 

3、加血清