[发明专利]从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度活化凝血七因子的方法

权利要求书

1.一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，包含以下步骤：

A.原料亲和层析纯化：

原料过亲和层析柱，并收集含有凝血七因子的洗脱液，所述亲和层析柱中的亲和层析介质上偶联有凝血七因子单克隆抗体，所述原料为：表达重组凝血七因子的细胞培养液或者将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分；

B.活化：

将经步骤A亲和层析纯化获得的含有凝血七因子的洗脱液在4℃-15℃温度条件下加入凝血酶及镁离子，共同孵化18-24小时实现凝血七因子的活化；

C.将步骤B的活化产物浓缩并进行病毒灭活获得最终产物。

2.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤B中，所述凝血酶的浓度为1-100IU/ml，所述镁离子的浓度为1-50mmol/l。

3.如权利要求2所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤B中，所述凝血酶的浓度为15IU/ml，Mg离子的浓度为10mmol/l。

4.如权利要求1或3所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤B中，所述镁离子来源于MgCl₂。

5.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤A中，所述亲和层析柱中的亲和层析介质为多糖类高分子亲水性物质，或者为采用多孔刚性支撑且表面覆盖有多糖类高分子亲水性物质的介质。

6.如权利要求5所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，所述多糖类高分子亲水性物质为葡聚糖或琼脂糖。

7.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤A中，所述亲和层析介质在与凝血七因子单克隆抗体偶联前，其羟基经化学修饰引入了高反应活性的小分子化学基团。

8.如权利要求7所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，所述的高反应活性的小分子化学基团为溴化氰、环氧基团或巯基。

9.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分为组分II+III或者为组分III。

10.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤A中，所述凝血七因子单克隆抗体与凝血七因子的亲和系数Ka为1.65×10⁸L/mol，在洗脱液存在下的解离系数Kd为6.06×10^-9M。

11.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤A中，所述凝血七因子单克隆抗体包括重链与轻链，其中重链氨基酸序列为：SEQ ID NO：1，轻链氨基酸序列为：SEQ ID NO：2。

12.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤A具体包括下列步骤：

1)原料前处理：

表达重组凝血七因子的细胞培养液的处理：细胞培养液经超滤浓缩后将pH调至7.0-8.0；

血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分的处理：组分用pH7.0-8.0的样品缓冲液复溶，调节溶液pH为7.0-8.0；

2)上样：亲和层析柱平衡，而后将经步骤1)处理后的原料上样，上样流速为每分钟0.5-100毫升；

3)洗脱：用pH2.0-pH5.0的洗脱缓冲液洗脱，收集凝血七因子组分。

13.如权利要求12所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，所述样品缓冲液为pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液或pH7.4三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液；所述洗脱缓冲液为pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液或pH2.5的醋酸/醋酸钠缓冲液。

14.如权利要求1所述从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步骤C中，病毒灭活为两步病毒灭活，第一步为纳米膜过滤，第二步病毒灭活为干热法病毒灭活。