[发明专利]从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度活化凝血七因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化高纯度活化凝血七因子的方法。

背景技术

凝血七因子(FVII)是一种依赖维生素K的糖蛋白，合成于肝脏，在血液中以很低的浓度存在(0.5mg/L)，并且主要以非活化的单链酶原形式存在，仅1％处于被活化状态。七因子酶原可以被活化的凝血第十二因子、十因子、九因子、七因子或者凝血酶激活而形成活化七因子(FVIIa)。七因子是启动外源凝血途径所必须的酶原，它的激活是外源性凝血途径的开始。活化七因子本身仅具有很低的蛋白酶解活性，而组织因子(TF)是活化七因子高度亲和的受体，一旦活化七因子与组织因子相结合，则具有很高的活性。当创伤破坏了细胞屏障，在创伤或炎症部位表达的组织因子进入血液循环，并与活化七因子相结合，进而凝血第十因子(FX)被激活为活化十因子(FXa)，导致少量凝血酶的产生，促使血小板在创伤部位凝集。活化七因子在血小板表面将凝血第十因子转化为活化十因子，经过一系列复杂的步骤，活化十因子在损伤部位形成血凝块。这种酶促反应局限在创伤部位，可能降低了全身凝血活化和血栓并发症的危险。这一外源凝血途径也成为解释活化七因子能够有特异性地快速发挥止血作用的原因。

临床上活化七因子已经被广泛应用于七因子缺乏症的预防和由于七因子缺乏导致的出血病症，以及存在有凝血因子八和九因子抗体(抑制物)的先天性血友病和继发性血友病患者的自发性或手术性出血。目前市场上仅有丹麦诺和诺德公司(Novo Nordisk)的诺琪(Novo Seven)，主要用于治疗先天性七因子缺乏症导致的出血病症，外科手术的出血，血友病等，2005年的销售额达到了近10亿美元，2006年上半年销售又增长19％。诺琪是利用基因重组技术在哺乳动物细胞中表达活化形式的凝血七因子。而且诺和诺德公司公司还在积极地不断拓展诺琪的临床适应症，国内外很多医院和临床医生已经将其广泛地应用在很多手术中，比如肝脏手术，肾移植，前列腺手术等。诺和诺德公司已经包括急性创伤性出血，烧伤性出血出血性休克，脑内出血和手术后出血进行了临床试验，因此活化七因子的市场前景非常广阔。

七因子可以用基因工程的方法用工程细胞表达，如CHO或BHK细胞等。这些工程细胞将七因子以单链酶原的形式分泌到细胞培养液中，需要进行进一步的分离纯化步骤已取得活化七因子纯品。

在用低温乙醇法生产血制品的过程中，非活化的七因子被富积在组分III中，由于工艺原因，不能将其单独分离纯化，最终加工成凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrate，PCC)，其中主要含有凝血因子II，VII，IX和X，它们都属于依赖维生素K的凝血因子。凝血酶原复合物目前被广泛应用于凝血因子II，VII，IX和X的缺乏症，肝病出血，维生素K缺乏症，外科手术异常出血，凝血因子八抑制物血友病和弥散性血管内凝血(DIC)。但由于PCC是几种凝血因子的混合物，在临床应用中很容易产生不良反应，如血栓栓塞等。因此，进一步分离纯化得到高纯度的凝血七因子，提高用药效率和安全性有着很重要的意义。与基因重组的七因子相比，从血浆中分离纯化七因子在成本上会具有较大优势。因此，开发新工艺，从血浆组分中分离七因子并制成活化的活化七因子制剂，将有广泛的市场前景，同时有利于提高血浆资源的综合利用率，减少血浆资源浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种从细胞培养液或血浆组分中分离纯化活化凝血七因子(FVIIa)的方法。

本发明的方法包含以下步骤：

A.原料亲和层析纯化：

原料过亲和层析柱，并收集含有凝血七因子的洗脱液，所述亲和层析柱中的亲和层析介质上偶联有凝血七因子单克隆抗体，所述原料为：表达重组凝血七因子的细胞培养液或者将血浆以低温乙醇法沉淀得到的富含七因子的组分。

B.活化：

将经步骤A亲和层析纯化获得的含有凝血七因子的洗脱液在4℃-15℃温度条件下加入凝血酶及镁离子，共同孵化18-24小时实现凝血七因子的活化。所述凝血酶的浓度为1-100IU/ml洗脱液，所述镁离子的浓度为1-50mmol/l洗脱液。镁离子来源于含镁化合物，含镁化合物优选MgCl₂。最优选的，所述凝血酶的浓度为15IU/ml，MgCl₂的浓度为10mmol/l。